Aufklärung des DNA-Spaltungsprozesses des Sau3AI-Enzyms

Sau3AI ist ein Typ-II-Restriktionsenzym, das häufig zur genetischen Manipulation, beispielsweise zum Aufbau einer Genombibliothek, verwendet wird. Sau3AI besteht aus zwei Domänen, der N-terminalen Domäne (Sau3AI-N) und der C-terminalen Domäne (Sau3AI-C). Wie diese beiden Domänen beim Schneiden von DNA zusammenarbeiten, bleibt unklar.

Kürzlich berichtete ein Forschungsteam unter der Leitung von Prof. YU Feng vom Shanghai Advanced Research Institute (SARI) der Chinesischen Akademie der Wissenschaften und Prof. HE Jianhua von der Universität Wuhan über einen selbstaktivierenden Mechanismus, bei dem die C-terminale Domäne von Sau3AI die öffnet N-terminale katalytische Domäne durch allosterische Effekte, um die Spaltung DNA-spezifischer Stellen zu erreichen.

Die Ergebnisse wurden am 30. August in Structure veröffentlicht.

Aufgrund der DNA-Spaltungsaktivität kann Sau3AI nicht in Escherichia coli exprimiert werden, und daher wurde eine Mutante der katalytischen Stelle, Sau3AI-E64A, für die exogene Expression und Strukturforschung verwendet. Die Kristallstruktur des Sau3AI-E64A-Mutanten zeigt, dass bei nicht gebundener DNA eine Schleifenregion (333–342) der C-terminalen Domäne über der DNA-Bindungsstelle der N-terminalen Domäne hängt und verhindert, dass die N-terminale Domäne daran bindet DNA.

Die Analyse der C-terminalen Domäne von Sau3AI und der DNA-Komplexstruktur ergab, dass die Schleifenregion (261–268 und 280–295) der C-terminalen Domäne nach der Bindung an die DNA signifikant verändert wurde, was darauf hindeutet, dass Sau3AI nach dem C-Terminus Konformationsänderungen erfahren kann Domäne bindet an DNA.

Darüber hinaus führten die Forscher ein Gelverschiebungsexperiment an Mutanten der DNA-bindenden Schlüsselaminosäurereste (K257A, S424A und T435A) in der C-terminalen Domäne durch, um zu bestätigen, dass die C-terminal bindende DNA eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung der katalytischen Aktivität von N- spielt. Terminaldomäne. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die C-terminale Domäne die enzymatische Aktivität der N-terminalen Domäne durch allosterische Effekte aktiviert.

Die Forscher vermuteten, dass Sau3AI ein Restriktionsenzym vom Typ IIE ist, aber im Gegensatz zu anderen Restriktionsenzymen vom Typ IIE eher ein Monomer als ein Homodimer ist. Zwei verschiedene Domänen in Sau3AI spielen eine ähnliche Rolle wie Homodimere in anderen Restriktionsenzymen vom Typ IIE, was darauf hindeutet, dass Sau3AI eine neue Unterklasse von Restriktionsenzymen vom Typ IIE darstellt.