Mutationslandschaft von Darmkryptazellen nach langer Zeit

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13964 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Fettleibigkeit ist ein veränderbarer Risikofaktor für die Krebsentstehung, insbesondere für Magen-Darm-Krebs. Während die Ätiologie von Darmkrebs durch die Adenom-Karzinom-Sequenz gut charakterisiert ist, bleibt unklar, welchen Einfluss Fettleibigkeit auf die Entstehung von Darmkrebs hat. Es wurde gezeigt, dass Nahrungsbestandteile einer fettreichen Ernährung zusammen mit Fettleibigkeit das Krebsrisiko modulieren, indem sie die Homöostase der Darmstammzellen stören. Wie sich Adipositas auf die Entwicklung einer genomischen Instabilität auswirkt, wurde jedoch nicht untersucht. Mutationssignaturen sind eine wirkungsvolle Methode, um zu verstehen, wie sich eine komplexe biologische Reaktion auf die genomische Stabilität auswirkt. Wir verwendeten ein Mausmodell für ernährungsbedingte Fettleibigkeit, um die Mutationslandschaft von Darmkryptazellen nach einer 48-wöchigen Exposition gegenüber einer experimentellen fettreichen Diät in vivo zu untersuchen. Durch die klonale Anreicherung einzelner Kryptenzellen in Organoidkulturen und die Gewinnung ganzer Genomsequenzen analysierten und verglichen wir die Mutationslandschaft von Darmepithelzellen von Mäusen mit normaler Ernährung und fettreicher Ernährung. In unserer Kohorte vorhandene Einzelnukleotid-Substitutionssignaturen und Indel-Signaturen sind in beiden Ernährungsgruppen gleichermaßen aktiv und spiegeln biologische Prozesse des normalen Alterns, der Zellreplikation und des oxidativen Stresses wider, die während der Organoidkultivierung induziert werden. Somit zeigen wir, dass ohne aktivierende Mutationen oder chemische Exposition eine fettreiche Ernährung allein nicht ausreicht, um die genomische Instabilität zu erhöhen.

Die weltweite Fettleibigkeitsrate ist in den letzten 40 Jahren stetig gestiegen1. Fettleibigkeit geht mit vielen Begleiterkrankungen einher, wie z. B. einem erhöhten Risiko für Typ-II-Diabetes, Bluthochdruck und einer nichtalkoholischen Fettlebererkrankung1, 2. Zu den größten gesundheitlichen Auswirkungen gehört das erhöhte Krebsrisiko, das mit der Ansammlung von Körperfett einhergeht3,4,5,6. Die Internationale Agentur für Krebsforschung (IARC) hat die überwältigenden epidemiologischen Beweise anerkannt, die einen Zusammenhang zwischen chronischer Fettleibigkeit und einem erhöhten Krebsrisiko, insbesondere für Organe entlang der Magen-Darm-Achse, herstellen7. Insbesondere das Risiko, an Darmkrebs (CRC) zu erkranken, wird stark von ernährungsbedingten Risikofaktoren und einem hohen Body-Mass-Index (BMI)8 beeinflusst. Angesichts des klaren Zusammenhangs zwischen einem hohen BMI und dem Darmkrebsrisiko könnte ein Verständnis der zugrunde liegenden Krankheitsätiologie sowohl präventive als auch therapeutische Programme beeinflussen.

Die Entwicklung von Darmkrebs wird durch eine gut beschriebene Mutationsprogression definiert, die als Adenom-Karzinom-Sequenz bekannt ist9. Deaktivierende Mutationen in adenomatösen Polyposis coli (APC) sind auslösende Mutationen, die zu einer konstitutiven Wnt/β-Catenin-Signalübertragung führen. Darmkrebs entsteht über drei verschiedene molekulare Wege: den chromosomalen Instabilitätsweg (CIN), den Mikrosatelliteninstabilitätsweg (MSI) und den CpG-Inselmethylierungsweg (CIMP)10. Obwohl die Entwicklung von CRC heterogen ist und manchmal überlappende Wege umfasst, sind alle drei Wege durch genomische Instabilität definiert, die den Erwerb weiterer Mutationen in einer Reihe von Tumorsuppressoren und Onkogenen ermöglicht, darunter KRAS und BRAF (häufig gegenseitig ausschließend), TP53, PIK3CA und SMAD410, 11. Interessanterweise wurde gezeigt, dass der gleichzeitige Verlust von APC und p53 ausreicht, um ein hohes Maß an chromosomaler Instabilität hervorzurufen, die für den CIN-Signalweg charakteristisch ist12. Trotz gut definierter molekularer Genetik bei der CRC-Entwicklung bleibt unklar, wie sich eine fettreiche Ernährung (HFD) auf diese Ereignisreihe auswirkt.

Mit dem Aufkommen fortschrittlicher Gewebekultivierungstechniken ist es möglich geworden, die relevantesten Zellpopulationen in vitro zu untersuchen13. Im Fall von CRC handelt es sich bei der Ursprungszellpopulation um die schnell zyklischen LGR5-positiven (Leucin-reiche Wiederholung mit G-Protein-gekoppeltem Rezeptor 5) Darmstammzellen (ISCs), die sich am Boden der Krypta befinden14. Es wurde gezeigt, dass diese Zellen empfindlich auf Ernährungs- und Stoffwechselstörungen reagieren und das Risiko der Krebsentstehung modulieren15,16,17,18. Es hat sich gezeigt, dass eine längere Exposition gegenüber HFD-Bestandteilen Stammzellenmerkmalen auf Nicht-Stammzell-Vorläuferzellen verleiht und so den Pool aktiv replizierender Zellen erhöht16, 19. Es wurde festgestellt, dass die HFD-Komponente Palmitinsäure diesen Effekt über die Aktivierung von PPAR-∂ auslöst ( Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor-Delta-Signalweg, der den kanonischen Wnt-Signalweg induziert16, 19. Ein weiterer wichtiger Metabolit, der häufig mit ernährungsbedingter Fettleibigkeit in Verbindung gebracht wird, ist Cholesterin. Es wurde festgestellt, dass eine längere Exposition gegenüber hohen Cholesterinwerten auch die Proliferation von ISCs vorantreibt und die Tumorentstehungsrate in einem APC-Mangel-Hintergrund erhöht17.

Obwohl gezeigt wurde, dass ein HFD die Signalübertragung in der Stammzellnische direkt moduliert, wurde die Auswirkung auf die Genomstabilität noch nicht untersucht. Über die Beschreibung von Mutationen in einzelnen Genen hinaus bieten Mutationssignaturen einen Rahmen für die systematische Untersuchung, wie genomische Instabilität bei der Krebsentstehung entsteht. Mutationssignaturen sind ein mathematisches Gerüst, das es ermöglicht, Mutationsmuster innerhalb ihres Sequenzkontexts zu definieren. Die spezifische Mutationsprägung einer Signatur im Genom spiegelt die Fehlregulation oder Dysfunktion von DNA-Schäden und Reparaturwegen sowie anderen biologischen Prozessen wider20. Seit der Konzeption von Mutationssignaturen im Jahr 201321, 22 ist es möglich geworden, Krebsgenome auf globaler Ebene zu untersuchen und Muster zu erfassen, die komplexe zugrunde liegende biologische Mechanismen beschreiben. Bottom-up-In-vitro-Studien, bei denen die mutagene Wirkung einer Exposition oder eines Gen-Knockouts gemessen wird, haben sich bei der Definition von Signaturursachen als besonders nützlich erwiesen23,24,25,26.

Hier untersuchten wir, ob die Exposition gegenüber einer längeren fettreichen Ernährung unterschiedliche Mutationsprozesse in Darmkryptazellen hervorruft. Da Mutationssignaturen biologisch komplexe Prozesse effektiv erfassen, dienen sie als gute Anhaltspunkte für die Untersuchung von Auswirkungen auf die Genomstabilität. Wir sequenzierten und analysierten klonale Darmorganoide von Mäusen, denen 48 Wochen lang eine experimentelle HFD verabreicht wurde. Nach Datenverarbeitung und Variantenaufruf erhielten wir eine ausreichende Anzahl von Mutationen mit Einzelbasensubstitution (SBS) und Indel (ID), um SBS- und ID-Signaturen sowie kodierende Mutationen zu untersuchen. Für beide Diätgruppen stellen wir erwartete Signaturen im Zusammenhang mit Alterung, Gewebekulturverarbeitung und Zellreplikation wieder her. Wir zeigen, dass die differenzielle Mutagenese nicht durch HFD allein initiiert wird, wenn keine anderen Störungsereignisse vorliegen, wie z. B. chemische Exposition oder Mutationen in CRC-Treibergenen.

Um die langfristigen Auswirkungen von Fettleibigkeit auf die genomische Stabilität in der Darmkrypta zu untersuchen, haben wir eine Kohorte altersentsprechender männlicher C57/BL6J-Mäuse aufgebaut (Abb. 1A). Nach der zufälligen Zuteilung in Käfige mit entweder Standardfutter (SD) oder HFD wurden die Mäuse im Alter von 5 Wochen 48 Wochen lang mit der jeweiligen Diät begonnen. In festgelegten Zeitintervallen von 6, 12, 28 und 48 Wochen wurde eine zufällige Teilprobe von HFD- und SD-Mäusen gezogen und geopfert, um ISCs für die Kultivierung zu ernten. Organoide wurden ausgewählt und bis zur Klonalität kultiviert, bevor ab dem letzten Zeitpunkt (48 Wochen) vollständige Genomsequenzen (30x) für 5 fettleibige und 5 magere Mäuse erhalten wurden. Für jede Maus wurden 4 unabhängige organoide Klone und der passende Schwanz sequenziert, um erworbene Varianten von Keimbahnvarianten zu unterscheiden. Die klonalen Organoidlinien nehmen eine zystische Morphologie an, die für Darmorganoide mit hohem Stammzellgehalt charakteristisch ist13 und sind positiv für die Lgr5-Expression (ergänzende Abbildung 1A, B).

(A) Schematische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs. (B) Makronährstoffe experimenteller Diäten, dargestellt als prozentualer Anteil an den Gesamtkalorien. HFD wird in Hellblau und SD in Hellbraun dargestellt. (C) Futterverbrauch pro Diätgruppe, gemessen pro Käfig und geteilt durch die Anzahl der Mäuse pro Käfig. Der Gruppendurchschnitt und die statistische Signifikanz sind oben angegeben (ungepaarter t-Test, zweiseitig). (D) Der Plasmacholesteringehalt in mg/dl wird pro Diätgruppe zu jedem Zeitpunkt des Zeitverlaufs angezeigt. N = 3 für jede Gruppe zu den Zeitpunkten Woche 6, 12, 28 und N = 5 in Woche 48 (paarweiser t-Test, zweiseitig). (E) Wöchentliche Gewichtsmessungen für Diätgruppen. Punkte zeigen Messungen für einzelne Mäuse an. Eine statistisch signifikante Gewichtszunahme wurde nach 3 Wochen auf dem HFD beobachtet (angezeigt durch die rote Linie). Die statistische Signifikanz wurde mithilfe mehrerer ungepaarter t-Tests mit Alpha = 0,001 getestet (Holm-Sidak-Korrekturmethode für mehrere Tests, keine Annahme einer konsistenten Standardabweichung zwischen den Gruppen). .

Unser Modell ernährungsbedingter Fettleibigkeit basiert auf der Wahl der zugeführten Nahrung. Bei fettreicher Ernährung beziehen Mäuse 60 % aller Kalorien aus Fett, während der Großteil der Kalorien bei normaler Ernährung (SD) aus Kohlenhydraten (55,5 %) stammt (Abb. 1B). Die genaue Nahrungszusammensetzung ist in den Ergänzungstabellen 1 und 2 beschrieben. Trotz eines geringeren Gesamtnahrungsverbrauchs in der HFD-Gruppe (Abb. 1C) war die mittlere wöchentliche Kalorienaufnahme in der HFD-Gruppe (92,7 kcal/Woche) höher als in der SD-Gruppe ( 80,2 kcal/Woche). C57BL/6J-Mäuse wurden als Modellorganismen für ernährungsbedingte Fettleibigkeit gut charakterisiert und erfassten wesentliche Aspekte der metabolischen Dysregulation und Gewichtszunahme27, 28. Unsere Kohorte zeigte auch einen deutlichen Anstieg des Gesamtcholesterins bei Exposition gegenüber HFD (Abb. 1D) und einen signifikanten Anstieg Anstieg des Körpergewichts nach 3 Wochen HFD (Abb. 1E), was die Stoffwechselstörungen und den daraus resultierenden Phänotyp im Zusammenhang mit Fettleibigkeit zusammenfasst.

Da das Genom vergangene und laufende Mutationsprozesse aufzeichnet, gingen wir davon aus, dass eine längere Exposition gegenüber HFD zu einem stärkeren Signal führen würde. Daher konzentrierten wir unsere Sequenzierungsbemühungen auf den letzten Zeitpunkt (48 Wochen). Die erhaltenen Rohdaten wurden gemäß den Best Practices von GATK (The Genome Analysis Toolkit) verarbeitet (Abb. 2A). Um einen Mutationssatz mit hoher Konfidenz zu erhalten, verwendeten wir zwei Mutationsaufrufer, Mutect229, 30 und Strelka231. Mutationen, die sowohl von Mutect2 als auch von Strelka2 gefunden wurden und die jeweiligen Qualitätsfiltereinstellungen bestanden haben, wurden zur weiteren Analyse einbezogen. Dies ergab insgesamt 48.742 Einzelnukleotidvarianten (SNV), 165 Doppelnukleotidsubstitutionen (DSB) und 6662 Indels (Insertionen und Deletionen). Aufgrund der geringen Anzahl an Mutationen wurden DSBs von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Als zusätzlichen Qualitätskontrollschritt überprüften wir die Verteilung der Varianten-Allelfrequenz (VAF) aller organoiden Klone und schlossen nur klonale Proben ein, bei denen die VAF-Verteilung bei etwa 0,5 liegt (ergänzende Abbildung 1C).

(A) Rohdaten aus der Paired-End-150-bp-Illumina-Sequenzierung wurden gemäß den Best Practices von GATK verarbeitet, einschließlich der Markierung und Entfernung von Duplikaten und der Neukalibrierung der Basisqualitätswerte. Analysebereite Lesevorgänge wurden von zwei Mutationsaufrufern verarbeitet, Mutect2 und Strelka2. Von beiden Tools aufgerufene Varianten wurden in die Analyse einbezogen. Insgesamt konnten 48.742 Einzelnukleotidvarianten, 165 Doppelbasensubstitutionsvarianten und 6662 Insertionen und Deletionen nachgewiesen werden. (B) Relativer Beitrag von SNVs in sechs Mutationsklassen für HFD-Proben (linkes Feld) und SD-Proben (rechtes Feld). C > T-Mutationen innerhalb von CpG-Stellen werden als separate Kategorie angezeigt. Einzelne Punkte zeigen Organoidproben an, Fehlerbalken zeigen ± 1 Standardabweichung vom Mittelwert an, Sternchen zeigen Ergebnisse aus dem paarweisen t-Test (zweiseitig) an, der die Mutationszahlen für jede Mutationskategorie vergleicht, Alpha = 0,05 (C). Durchschnittliches Mutationsprofil von SNVs in 96 Angezeigte Kanäle für HFD (oberes Feld) und SD (unteres Feld). Fehlerbalken zeigen ± 1 SD an.

Wir haben zunächst die gesamte Mutationslandschaft für SNVs pro Diätgruppe untersucht. Überraschenderweise fanden wir in der SD-Gruppe eine etwas höhere Gesamtzahl an Mutationen als in der HFD-Gruppe. Wir beobachteten eine signifikant höhere Anzahl von Mutationen in der SD-Gruppe für C > G, C > T außerhalb der CpG-Regionen, T > C und T > G (Abb. 2B). Das Profil der relativen Beiträge über die 7 Mutationskanäle hinweg ist jedoch zwischen den beiden Ernährungsgruppen ähnlich. Als nächstes untersuchten wir die Mutationsprofile in 96 Kanälen. Das mittlere Mutationsprofil pro Diätgruppe weist mit Ausnahme der C > A- und C > T-Komponenten nur wenige charakteristische Spitzen auf. Das aggregierte Profil der HFD-Gruppe weist eine Kosinusähnlichkeit von 0,9929 mit der SD-Gruppe auf (Abb. 2C). Darüber hinaus beobachten wir sehr ähnliche Profile zwischen Mäusen beider Ernährungsgruppen (ergänzende Abbildung 2A, B). Um zu quantifizieren, wie ähnlich die Mutationsprofile der Proben verschiedener Ernährungsgruppen sind, haben wir die paarweise Kosinusähnlichkeit zwischen allen Proben berechnet, die zwischen 0,9020 und 0,9776 (Mittelwert = 0,9558) liegt (ergänzende Abbildung 2C).

Die hohe Kosinusähnlichkeit zwischen allen Proben impliziert das Fehlen starker differentieller Mutationsprozesse. Um dies zu testen, verwendeten wir eine Bootstrap-Resampling-Methode der 96-Kanal-Mutationsmatrix, angepasst von Zou et al., für SD- und HFD-Proben24. Dadurch können wir potenzielle qualitative Unterschiede in Mutationsprofilen erkennen, die aufgrund der geringen Stichprobengröße und des hohen Signal-Rausch-Verhältnisses unentdeckt bleiben. Das globale Bootstrapped-Mutationsprofil der SD-Mäuse weist im Vergleich zum Profil der HFD-Mäuse eine Kosinusähnlichkeit von 0,9933 auf (ergänzende Abbildung 2D).

Zusammenfassend deutet dies darauf hin, dass in beiden Ernährungsgruppen keine starken qualitativen Unterschiede für mutagene Prozesse bestehen.

Trotz des Mangels an qualitativen Unterschieden in den Mutationsprofilen der beiden Ernährungsgruppen versuchten wir als Nächstes zu untersuchen, welche Mutationssignaturen in den Ernährungsgruppen aktiv sind, um festzustellen, ob quantitative Unterschiede bestehen. Wir verwendeten zunächst nicht-negative Matrixfaktorisierung (NMF) mit automatischer Rangauswahl basierend auf der NMFk-Methode, um die optimale Anzahl der zu extrahierenden De-novo-Signaturen zu bestimmen32, 33. Klassischerweise verwenden NMF-Algorithmen Heuristiken, um den optimalen Rang basierend auf einer der beiden Stabilitäten zu bestimmen der Lösung oder auf der automatischen Relevanzbestimmung (ARD), die ein Maß für die Präzision des gewählten Modells zur Erklärung der Daten ist33. Im Gegensatz dazu zielt die NMFk-Methode zur automatischen Rangbestimmung darauf ab, den Kompromiss zwischen der Stabilität der Lösung und der Genauigkeit der rekonstruierten Daten, gemessen als Abstand zwischen Original- und rekonstruierten Profilen (mittlerer Stichprobenkosinusabstand), zu optimieren. Diese Methode ermöglicht die robuste Extraktion einer aussagekräftigen Anzahl von Signaturen aus verrauschten Daten und minimiert gleichzeitig die Anzahl falsch positiver Signaturen32.

Auf unsere Daten angewendet, nehmen sowohl die Stabilität als auch der mittlere Kosinusabstand der Stichprobe ab, je mehr Signaturen extrahiert werden. Daher besteht die optimalste Lösung darin, eine einzelne Signatur zu extrahieren (Abb. 3A). Das Vorhandensein eines einzigen Konsensprofils in der Kohorte würde darauf hinweisen, dass es keine Unterscheidungsmerkmale zwischen den Ernährungsgruppen gibt. Die de-novo-extrahierte Signatur kann außerdem in bekannte Signaturen aus der Datenbank des Katalogs somatischer Mutationen bei Krebs (COSMIC) zerlegt werden34. Gemäß dieser Zerlegung besteht die De-novo-Signatur aus 48,1 % SBS5, 42,56 % SBS18 und 9,34 % SBS1 (Abb. 3A). Der Vergleich des Beitrags der zerlegten Signaturen pro Probe zeigt eine gleichmäßige Verteilung der Signaturaktivitäten über die Proben hinweg, unabhängig von der verwendeten Ernährung (Abb. 3B).

(A) NMF zur Signaturextraktion im Bereich von 1 bis 4 Signaturen. Die rote Linie zeigt den mittleren Probenkosinusabstand (MSCD), die blaue Linie die durchschnittliche Stabilität (AS) und der graue Balken die bevorzugte Lösung an, wodurch der Kompromiss zwischen MSCD und AS maximiert wird. Rechts ist die Zerlegung der extrahierten Signatur in bekannte KOSMISCHE Signaturen und deren berechneter prozentualer Beitrag dargestellt. (B) NMF-Ergebnisse von A, dargestellt als absolute Signaturbeiträge der Probe (Anzahl der Mutationen), der Ernährungsstatus der Proben ist unten angegeben. (C) Beste Teilmengen-Signatur-Umrüstung unter Verwendung von Signaturen, die häufig bei Darmkrebs aktiv sind. Pro Probe werden die absoluten Signaturbeiträge (Anzahl der Mutationen) für HFD-Proben (oberes Feld) und SD-Proben (unteres Feld) angezeigt. (D) Signaturpräsenztest für die 4 aktivsten Signaturen. Die y-Achse gibt das Wahrscheinlichkeitsverhältnis zwischen der Signaturanpassung mit und ohne getestete Signatur an. Die Durchsichtigkeit der Balken, die für einzelne Organoidklone angezeigt werden, gibt Aufschluss über den Grad der Signifikanz (-log p).

In Kohorten mit geringeren Probenzahlen wie unserer besteht ein alternativer Ansatz zur De-novo-Extraktion in der Neuanpassung von Signaturen, bei der der Mutationskatalog der Proben an den Katalog bekannter Signaturen (COSMIC) angepasst wird, um eine Teilmenge zu finden, die die beobachtete Mutation am besten erklärt Katalog. Dieser Ansatz verwendet einen definierten Satz bekannter Signaturen und führt iterativ eine Überarbeitung durch. Nach jeder Iteration werden das rekonstruierte und das ursprüngliche Profil verglichen und die Signatur mit dem niedrigsten Beitrag wird aus dem Satz entfernt. Signaturen werden nicht mehr entfernt, wenn sich die Kosinusähnlichkeit zwischen dem rekonstruierten und dem ursprünglichen Profil zwischen zwei Iterationen um mehr als einen bestimmten Schwellenwert geändert hat. Somit bleiben nur die Signaturen im Satz erhalten, die zur Modellierung der beobachteten Daten erforderlich sind. Indem wir diesen Vorgang n − 1 Mal für alle Mengen von n − 1, n − 2, n − 3 usw. wiederholen, wobei n die Gesamtzahl der bekannten Signaturen ist, finden wir, dass SBS1, SBS5, SBS18 und SBS40 99,6 % erklären der beobachteten Mutationen in beiden Diätgruppen (Abb. 3C). Nur vier Proben zeigten eine minimale Aktivität von SBS15 (Defective Mismatch Repair), eine Signatur, die direkt auf eine Zunahme der genomischen Instabilität zurückzuführen ist. Die gleichermaßen geringe Anzahl von Mutationen, die SBS15 in beiden Ernährungsgruppen zugeschrieben werden, lässt jedoch darauf schließen, dass SD und HFD kein unterschiedliches Potenzial für die Reparatur von Fehlpaarungen aufweisen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verteilung der angepassten Signaturen in allen Proben sehr ähnlich ist und nicht ernährungsspezifisch ist.

Um die Aktivität der aktivsten Signaturen zu quantifizieren, haben wir den Signaturpräsenztest aus dem mSigAct-Paket35, 36 auf SBS1, SBS5, SBS18 und SBS40 angewendet. Dieser statistische Test erstellt zwei Refit-Modelle, eines mit und eines ohne die interessierende Signatur, und minimiert gleichzeitig den Rekonstruktionsfehler. Anschließend wird der Likelihood-Ratio-Test zwischen den beiden Modellen berechnet. Bei Verhältnissen größer als 1 ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Signatur aktiv ist, deutlich höher als bei der Alternativhypothese. Der Signaturpräsenztest bestätigte die Ergebnisse der Signaturumrüstung. Von den 4 getesteten Signaturen ist SBS5 die am wenigsten aktive, wie bereits zuvor beobachtet (Abb. 3D). Obwohl zwischen einzelnen Proben eine gewisse Variation der Signaturaktivität beobachtet werden kann, zeigt keine Signatur einen systematischen Unterschied zwischen den Diäten.

Alle von uns gefundenen Signaturen sind in beiden Ernährungsgruppen gleichermaßen aktiv und wahrscheinlich auf normale Alterungsprozesse und den Kultivierungsprozess vor der Sequenzierung zurückzuführen. SBS1 ist eine uhrartige Signatur, die dem Altern aufgrund der spontanen Desaminierung von 5-Methylcytosinen zugeschrieben wird, die zu einem C > T-Übergang führt21. Die in beiden Gruppen beobachtete Aktivität von SBS1 spiegelt daher wahrscheinlich den normalen Alterungsprozess wider. Darüber hinaus zeigten beide Gruppen eine hohe Anzahl an C > A-Mutationen, die größtenteils SBS18 zugeschrieben wurden. Es wurde vermutet, dass diese Signatur durch Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies22, 25 verursacht wird und daher möglicherweise während der routinemäßigen experimentellen Handhabung der Proben oder aufgrund der Exposition gegenüber Stoffwechselnebenprodukten im Darm entstanden ist. Die übrigen Signaturen SBS5 und SBS40 haben ähnlich flache Profile. Obwohl nur SBS5 eindeutig als uhrähnliche Signatur identifiziert wurde, wurde auch festgestellt, dass SBS40 mit dem Alter korreliert22, 37. Somit kann die Aktivität beider Signaturen durch normale Alterungsprozesse erklärt werden. Zusammengenommen bestätigen die Ergebnisse der De-novo-Extraktion und der Signaturumrüstung, dass die experimentelle HFD im Vergleich zur Standarddiät keine unterschiedlichen Mutationsprozesse für einzelne Nukleotidsubstitutionen induziert oder beeinflusst.

Neben SNVs erzeugen zahlreiche Mutationsprozesse auch Insertionen und Deletionen. Diese Mutationsklasse erzeugt Signaturen, die sich von SNV-Signaturen unterscheiden. Wir haben daher die 6662 Indel-Mutationen in unserer Kohorte analysiert, um zu vergleichen, ob zwischen den Ernährungsgruppen Unterschiede in den Indel-erzeugenden Mutationsprozessen bestehen. Wir haben nur klonale Proben mit einer VAF-Verteilung um 0,5 berücksichtigt (ergänzende Abbildung 3). Indel-Mutationen können in 16 oder 83 kuratierten Kanälen analysiert werden, die den Haupt- bzw. erweiterten Sequenzkontext darstellen38. Die kuratierten Indel-Typen reichen von der Deletion oder Insertion eines einzelnen Basenpaars bis hin zu Indels, die länger als 5 bp sind. Darüber hinaus werden Deletionen von 1–5 bp, flankiert von Mikrohomologien, berücksichtigt, da solche Mutationen auf fehlerhafte Reparaturprozesse von Doppelstrangbrüchen hinweisen39. Indel-Profile in beiden Sequenzkontexten waren zwischen den Ernährungsgruppen sehr ähnlich, mit einer Kosinusähnlichkeit von 0,9925 für Haupt-Indel-Kontexte (Abb. 4A) und 0,9941 für erweiterte Indel-Kontexte (Abb. 4B). Lediglich Deletionen von mehr als 5 bp, flankiert von Mikrohomologien, waren in der SD im Vergleich zur HFD-Kohorte signifikant erhöht (Abb. 4A). Da die Gesamtzahl der Mutationen in dieser Kategorie jedoch weniger als 10 beträgt, handelt es sich wahrscheinlich um eine zufällige Variation und hat keine spezifische biologische Bedeutung. Tatsächlich zeigten alle Mäuse, unabhängig von der Ernährungsgruppe, sehr ähnliche Indelprofile, sowohl für den Haupt- als auch für den erweiterten Sequenzkontext (ergänzende Abbildung 4A – D). Darüber hinaus zeigten alle Proben eine paarweise Kosinusähnlichkeit von mehr als 0,84 (ergänzende Abbildung 4E). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hohe Kosinus-Ähnlichkeit zwischen den Indel-Profilen der Diätgruppen sowie zwischen einzelnen Proben darauf hindeutet, dass keine Indel-erzeugenden Prozesse für eine der beiden Diäten einzigartig sind.

(A) Haupt-Indel-Kontextprofile (16 Kanäle), aggregiert nach Diätgruppe (Mittelwert), Fehlerbalken zeigen ± 1 Standardabweichung an. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe mehrerer paarweiser t-Tests bewertet, ohne dass eine konsistente Standardabweichung angenommen wurde (Holm-Sidak-Korrekturmethode für mehrere Tests, Alpha = 0,01). (B) Mittleres erweitertes Kontext-Indelprofil nach Diätgruppe (83 Kanäle), Fehlerbalken zeigen ± an 1 sd vom Mittelwert. (C) NMF-Diagnosediagramm für die Signaturextraktion im Bereich von 1 bis 4 Signaturen. Die rote Linie zeigt den mittleren Probenkosinusabstand (MSCD), die blaue Linie die durchschnittliche Stabilität (AS) und der graue Balken die bevorzugte Lösung an, wodurch der Kompromiss zwischen MSCD und AS maximiert wird. Rechts ist die Zerlegung der extrahierten Signatur in bekannte KOSMISCHE Indel-Signaturen und deren berechneter prozentualer Beitrag dargestellt. (D) NMF-Ergebnisse von A, dargestellt als absolute Signaturbeiträge der Probe (Anzahl der Mutationen), der Ernährungsstatus der Proben ist auf der x-Achse angegeben. (E) Beste Teilmengen-Signatur-Umrüstung unter Verwendung aller 18 bekannten Indel-Signaturen. Pro Probe werden die absoluten Signaturbeiträge (Anzahl der Mutationen) angezeigt. Der Ernährungsstatus wird auf der x-Achse angezeigt. (F) Bootstrapped-Refiting von Indel-Signaturen (Best-Subset-Ansatz unter Verwendung aller bekannten Indel-Signaturen, 100 Iterationen). Die Größe der Punkte gibt den durchschnittlichen Beitrag der Signatur für alle Bootstrap-Iterationen an, in denen diese Signatur gefunden wurde. Die Farbskala stellt den Prozentsatz der Bootstrap-Iterationen dar, bei denen die Signatur als aktiv befunden wurde. (G) Signaturpräsenztest für die 4 aktivsten Signaturen, die beim Refitting und Bootstrapped Refitting gefunden wurden. Die x-Achse zeigt die Stichprobe, die y-Achse das Wahrscheinlichkeitsverhältnis zwischen der Signaturanpassung mit und ohne getestete Signatur. Die Durchsichtigkeit der Balken, die für einzelne Organoidklone angezeigt werden, gibt Aufschluss über das Signifikanzniveau (− log p).

Als nächstes haben wir den gleichen Analyseworkflow, den wir für SNV-Signaturen eingerichtet haben, auf alle Einfügungen und Löschungen angewendet. NMF mit automatischer Rangauswahl stellte fest, dass eine Indel-Signatur die optimale Lösung war, da die Extraktion von mehr als einer Signatur zu einem starken Rückgang der durchschnittlichen Stabilität führte (Abb. 4C, linkes Feld). Die Zerlegung der einzelnen De-novo-Signatur ergab, dass drei bekannte COSMIC-Signaturen aktiv waren: ID1 (22,46 %), ID2 (40,88 %) und ID12 (36,66 %) (Abb. 4C, rechtes Feld). Die Verteilung des Signaturbeitrags auf die einzelnen Proben unterscheidet sich nicht zwischen den Diätgruppen (Abb. 4D).

Durch die weitere Untersuchung der Indel-Signaturen mit einer Refit-Analyse konnten wir die Ergebnisse der De-novo-Extraktion bestätigen. Unter Verwendung der besten Teilmengenumrüstung mit allen 18 bekannten Indel-Signaturen stellen wir fest, dass ID1, ID2 und ID12 am aktivsten und ähnlich über die Proben verteilt sind (Abb. 4E). Die für ID7 (MMR-Mangel37) und ID9 (Ätiologie unbekannt37) beobachtete geringe Aktivität kann auf eine falsche Zuordnung der Signaturen für die in unserer Kohorte häufigen C- und T-Deletionen zurückzuführen sein. Da die geringe Anzahl an Mutationen in dieser Analyse möglicherweise einschränkend ist, haben wir auch die Mutationsmatrix jeder Diätgruppe zusammengefasst und eine Neuanpassung der besten Teilmenge aller COSMIC-Indel-Signaturen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen eine gleichmäßige Verteilung der ID1-, ID2- und ID12-Aktivität über die Ernährungsgruppen hinweg (ergänzende Abbildung 4F). Um die Stabilität der Umrüstung zu bestätigen, führten wir eine Bootstrapping-Umrüstung durch. Die Mutationsmatrix wird 1000-mal mit Ersatz erneut abgetastet, wobei das ursprüngliche Mutationsprofil als Gewicht verwendet wird. Für jede Bootstrap-Iteration wird ein Refit berechnet und die geschätzte Signaturaktivität aufgezeichnet. Je höher der Konsens der Umrüstungen über Bootstrap-Iterationen hinweg ist, desto stabiler ist die Umrüstung. Die Ergebnisse bestätigen, dass ID1, ID2 und ID12 unabhängig von der aufgenommenen Ernährung die aktivsten Signaturen in unserer Kohorte sind. ID7 erwies sich nur in der SD-Gruppe als aktiv und wurde weniger als 10 % aller Mutationen in dieser Gruppe zugeschrieben (Abb. 4F). Schließlich haben wir die Signaturaktivität von ID1, ID2, ID7 und ID12 für alle Proben mithilfe des Signaturpräsenztests quantifiziert (Abb. 4G). Die Ergebnisse bestätigen, dass ID2 und ID12 (Ätiologie unbekannt37) die aktivsten Signaturen in beiden Diätgruppen sind, da die Mehrheit der Mutationen in allen Proben auf diese Signaturen zurückzuführen ist. ID1 ist die drittaktivste Indel-Signatur, gefolgt von ID7, die nur in einigen Proben aktiv ist und in 23 % aller Proben vollständig fehlt.

Keine der identifizierten Indel-Signaturen ist zwischen den getesteten Diäten unterschiedlich aktiv. Es wird angenommen, dass die Signaturen ID1 und ID2 beide aufgrund des Verrutschens des replizierten (ID1) und des Matrizenstrangs (ID2) während der Replikation entstehen, wodurch die charakteristischen 5 + bp T-Insertionen und 6 + bp T-Deletionen entstehen. Es wurde beobachtet, dass diese Signaturen in allen Proben aktiv sind und nur in Hintergründen mit Mismatch-Repair-Defizienz (MMR) erhöht sind37. In unserer Kohorte haben wir weder eine starke Aktivität von SNV- noch Indel-Signaturen im Zusammenhang mit der fehlerhaften Fehlpaarungsreparatur beobachtet. Die geringe Aktivität der MMR-Mangelsignatur ID7 in einigen Proben könnte teilweise die hohe Aktivität erklären, die für ID1 und ID2 beobachtet wurde. Dieser Prozess ist jedoch in beiden Ernährungsgruppen gleichermaßen aktiv (Abb. 4E,G). Bemerkenswerterweise wurde festgestellt, dass die ID1- und ID2-Aktivität bei Patienten mit chronischer Entzündung des Darmtrakts erhöht war40. Obwohl Fettleibigkeit mit Veränderungen der metabolischen und hormonellen Signalübertragung verbunden ist, die mit der Bildung einer entzündlichen Umgebung einhergehen6, beobachten wir keinen Anstieg der ID1- und ID2-Aktivität, der auf starke Veränderungen der Entzündungssignalisierung hinweisen würde. Daher lässt die Aktivität von ID1 und ID2, die wir in beiden Ernährungsgruppen finden, auf Mutationsprozesse schließen, die während der normalen Zellreplikation ablaufen. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die experimentelle HFD keine Mutationsprozesse der Indel-Erzeugung hervorrief oder beeinflusste.

Schließlich fragten wir uns, ob das Fehlen spezifischer Mutationsprozesse auch die Anhäufung spezifischer schädlicher Mutationen ausschließt, die die Adenom-Karzinom-Sequenz auslösen und somit die Tumorentwicklung prädisponieren könnten. Um dies zu testen, untersuchten wir die kodierenden Mutationen, die sich in beiden Ernährungsgruppen anhäuften. Aufgrund der geringen Anzahl kodierender Mutationen in unserer Kohorte haben wir alle Mutationen einbezogen, die die Filterkriterien des Mutect2-Variantenaufrufers erfüllten. Die Filterung nach den am stärksten mutierten Genen ergab eine bemerkenswerte Überlappung: 9 der zehn am häufigsten mutierten Gene werden von der SD- und der HFD-Gruppe gemeinsam genutzt (Abb. 5A, B). Der größte Teil der Veränderungen sind Missense-Mutationen. Keines der mutierten Gene spielt eine bekannte Rolle bei der Entstehung von Darmkrebs. Insgesamt fanden wir keine spezifischen Mutationen, die erklären könnten, wie Fettleibigkeit das Risiko einer Krebsentstehung im Darmtrakt erhöht.

(A) Top 10 kodierende Mutationen bei HFD- (B) und SD-Mäusen. Die Art der Ersetzung wird farblich angezeigt. Der Prozentsatz der Proben mit einer Mutation im Gen ist rechts angegeben.

Fettleibigkeit ist eine chronische Krankheit, die epidemiologisch nachweislich das Risiko für die Entstehung von Krebs im Darmtrakt erhöht3,4,5,6,7. Es wurde gezeigt, dass ein hoher BMI und Ernährungsfaktoren wie der Verzehr einer fettreichen westlichen Ernährung einen positiven Zusammenhang mit dem Darmkrebsrisiko haben, da die Signalübertragung in der Nische der Darmstammzellen moduliert wird15,16,17,18,19. Die Auswirkung von Fettleibigkeit auf die genomische Stabilität von Darmstammzellen wurde jedoch noch nicht untersucht. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine chronische Exposition gegenüber einem HFD Auswirkungen auf DNA-Schäden und Reparatursignale oder damit verbundene Prozesse hat und somit die Landschaft der genomischen Stabilität in Darmstammzellen prägt. Um die Mutationslandschaft als Reaktion auf ernährungsbedingte Fettleibigkeit zu untersuchen, verwendeten wir die Sequenzierung des gesamten Genoms an klonalen Organoidpopulationen, die aus Darmkryptazellen von Mäusen stammen, die experimentell einer fettreichen bzw. Kontrolldiät ausgesetzt waren.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass HFD allein vor einem isogenen Hintergrund und in Abwesenheit anderer prädisponierender Mutationen im Vergleich zu einer Standard-Kontrolldiät keine unterschiedlichen Mutationssignaturen hervorruft. Alle von uns gefundenen Mutationssignaturen sind in beiden Ernährungsgruppen gleichermaßen aktiv und stellen normale, laufende Mutationsprozesse dar, die mit Alterung (SBS1, SBS5), Zellreplikation (ID1, ID2) oder oxidativem Stress verbunden sind, der entweder in vivo oder während des Kultivierungsprozesses während der Probe auftritt Vorbereitung (SBS18). Insgesamt stimmen die von uns wiederhergestellten Signaturen mit früheren Erkenntnissen überein und berichten über die Aktivität von SBS1, 5 und 18 sowie ID1 und ID2 als normale Alterungs- und Stoffwechselprozesse in Dickdarmkrypten40. Weitere gefundene Signaturen waren SBS40 und ID12, beides Signaturen mit unbekannter Ätiologie, die in beiden Diätgruppen aktiv waren. Darüber hinaus fanden wir keine kodierenden Mutationen in häufigen CRC-Treibergenen oder anderen Genen, die mit der Entwicklung einer genomischen Instabilität verbunden sind. Wenn also keine anderen prädisponierenden Mutationen vorliegen, reichen ernährungsbedingte Veränderungen an molekularen Signalwegen in der Stammzellnische, die mit Fettleibigkeit einhergehen, nicht aus, um einen Überschuss an Mutationen, spezifischen Mutationsmustern oder kodierenden Mutationen zu erzeugen, die für Krebs prädisponieren würden. Das Fehlen einer Mutagenese bei der HFD-Erkrankung, sowohl in Bezug auf die Anzahl der Mutationen als auch auf die Mutationssignaturen, lässt darauf schließen, dass die DNA-Reparaturmaschinerie bei der ernährungsbedingten Adipositas-Erkrankung effizient arbeitet und die genomische Stabilität gewährleistet. Obwohl wir in dieser Studie keine epigenetischen Veränderungen untersucht haben, ist bekannt, dass HFD eine epigenetische Umgestaltung der Enhancer-Landschaft in murinen Kolonepithelzellen induziert und Enhancer von CRC-assoziierten Genen aktiviert41, 42. Eine längere Exposition gegenüber HFD führt schließlich zu einer Neuprogrammierung der Transkription und einer Herunterregulierung Tumorsuppressoren, während gleichzeitig Gene, die mit einer verstärkten Proliferation verbunden sind, hochreguliert werden, ohne dass in Abwesenheit weiterer Stressfaktoren Tumore entstehen43. Betrachtet man unsere Ergebnisse im Kontext früherer Studien, würde dies darauf hindeuten, dass sich sowohl epigenetische Veränderungen als auch die Regulierung der DNA-Schadens- und Reparaturmaschinerie als Reaktion auf HFD ändern und das Darmepithel auf die Entstehung von Krebs vorbereiten. Wie sich ein HFD auf die Mutagenese in einem krebsvorbereitenden Hintergrund (z. B. ApcMin) oder in Gegenwart von DNA-schädigenden Stoffen auswirkt, muss noch untersucht werden.

Angesichts überzeugender epidemiologischer Beweise bleibt es wichtig zu verstehen, wie eine westliche Ernährung das Krebsrisiko im Magen-Darm-Trakt moduliert. Durch die Untersuchung der Mutagenese in Darmkryptazellen bei langfristiger Exposition gegenüber einer fettreichen Diät in vivo zeigen wir, dass HFD allein ohne andere Störungsereignisse wie Mutationen oder chemische Exposition nicht ausreicht, um spezifische Mutationsmuster auszulösen. Unsere Ergebnisse könnten zu zukünftigen Studien führen, um die kombinatorischen Effekte von HFD mit anderen Störungen zu untersuchen und die Ätiologie von durch Fettleibigkeit verursachten Krebsarten weiter aufzuklären.

Alle Versuchsprotokolle wurden vom institutionellen Tierversuchsausschuss der Medizinischen Universität Wien und dem österreichischen Wissenschaftsministerium unter der ethischen Genehmigungsnummer 66.009/0179-V/3b/2019 genehmigt. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Die Studie wurde gemäß den ARRIVE-Richtlinien berichtet. Bei den Versuchsmäusen handelte es sich um gleichaltrige Männchen mit einem C57BL/6J-Hintergrund. Die Gesamtzahl der in die Studie einbezogenen Mäuse betrug 28. Kontroll- und Behandlungsgruppen (Diätgruppen) wurden vor der Zugabe der experimentellen Forschungsdiäten nach dem Zufallsprinzip Käfignummern zugewiesen. Die Forscher waren gegenüber der zugewiesenen Behandlung nicht blind.

Kurz gesagt, ab einem Alter von 5 Wochen, nach einer einwöchigen Akklimatisierungsphase an SD, wurden Mäuse 6, 12, 28 und 48 Wochen lang mit SD oder HFD gefüttert (Forschungsdiäten, D12492i, Nagetierdiät mit 60 kcal % Fett, für Diät). Zusammensetzung siehe Ergänzungstabellen 1, 2). Die Mäuse wurden in der Abteilung für Versuchstierkunde und Genetik der Medizinischen Universität Wien, Österreich, mit einem 12-stündigen Dunkel-/Lichtzyklus und ad libitum Zugang zu Wasser und Futter gehalten. Gewichtszunahme und Futterverbrauch der Versuchstiere wurden wöchentlich überwacht. Bei experimentellem Exitus wurden die Mäuse nach 3-stündigem Fasten getötet. Für die Organoidkultur wurden Blut, Plasma, Darmgewebe und Darmkrypten aus dem Jejunum isoliert. Mit einer Spritze wurde Blut aus der Hohlvene gesammelt, in EDTA-haltigen Sammelröhrchen aufbewahrt und bei 2000 g auf 15 Minuten zentrifugiert. Das überstehende Plasma wurde entnommen und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Isoliertes Gewebe aus dem Jejunum wurde mithilfe einer Spritze vorsichtig mit eiskaltem PBS (20 ml, ohne Mg++ und Ca++) gespült. Das Darmrohr wurde der Länge nach aufgeschnitten und mit frischem PBS (1–2 ml, ohne Mg++ und Ca++) bedeckt. Die Zotten wurden vorsichtig mit einem Mikroskop-Deckglas abgekratzt. Anschließend wurde das Gewebe in ca. 0,5 cm lange Stücke schneiden und in ein Röhrchen mit eiskaltem PBS (50 ml, ohne Mg++ und Ca++) geben. Die Gewebestücke wurden gewaschen, indem das Röhrchen vorsichtig umgedreht wurde, bevor die Gewebestücke gesammelt wurden, und dieser Waschvorgang noch zweimal mit frischem PBS wiederholt wurde. Nach dem Waschen wurden Gewebestücke gesammelt und in enzymfreiem Dissoziationspuffer (StemCell-Katalog Nr. 100-0485) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer Rohrwalze inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Röhrchen kräftig geschüttelt, um die Krypten vom restlichen Gewebe zu lösen. Die resultierende Lösung wurde durch ein 70-µm-Zellsieb filtriert und 3 Minuten lang bei 1200 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in frischem PBS (1 ml) resuspendiert. Mehrere Aliquots von 50 µL, 100 µL und 200 µL wurden in 1,5-ml-Röhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 500 rcf zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig entfernt und Matrigel (20 µL) hinzugefügt und mit dem Pellet vermischt. Die Mischung wurde in Gewebekulturplatten mit 48 Vertiefungen (20 µl pro Vertiefung) ausplattiert, die Platte umgedreht und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, damit das Matrigel polymerisieren konnte. Abschließend wurden die Tröpfchen mit 250–300 µL WENR-Kultivierungsmedium (Advanced DMEM/F12, 1 % Glutamax (200 mM), 1 % HEPES (1 M), 1 % Penicillin/Streptomycin, 2 % B27 (50x, Thermo) bedeckt Fischer Katalog-Nr. 17504044), 0,25 % n-Acetyl-l-cystein (500 mM), 0,05 % rekombinantes murines EGF (500 µg/ml), 0,1 % rekombinantes murines Noggin (100 µg/ml, Peprotech-Katalog Nr. 250-38) , 0,2 % Primocin (50 mg/ml, InVivoGen Katalog #ant-pm-05), 0,01 % Y-27632 (100 mM, Adooq Bioscience Katalog #A11001-50), 1 % Nicotinamid (1 M), 50 % Wnt3A konditioniert Medium wie zuvor beschrieben, 10 % R-Spondin-konditioniertes Medium, hergestellt wie zuvor beschrieben).

Nach 5–7 Tagen in Kultur wurden die Organoide aus Matrigel gewonnen und unter Verwendung von 0,05 % Trypsin-EDTA (Inkubation bei 37 °C für 5–12 Minuten) und mechanischem Aufschluss durch kräftiges Pipettieren in einzelne Zellen dissoziiert. Einzelne Zellen wurden in zunehmend verdünnten Aliquots ausplattiert und unter dem Mikroskop auf vollständige Dispersion überprüft. Die resultierenden klonalen Organoide wurden nach 7–10 Tagen in der Kultur mit einer Pipette gepflückt (Mediumwechsel alle 2–3 Tage), mit 0,05 % Trypsin-EDTA aufgeschlossen und kultiviert, bis genügend Material für die DNA-Extraktion verfügbar war.

Organoide wurden in kaltem DMEM/F12 geerntet, durch Zentrifugation bei 500 rcf für 5 Minuten pelletiert und mit 1x TrypLE für 5 Minuten bei 37 °C verdaut. Nach der Verdauung wurden die Organoide mit kaltem PBS gewaschen und durch 5-minütige Zentrifugation bei 500 rcf pelletiert. Zellpellets wurden in 50 µL RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS, 50 ml TRIS pH 8,0) resuspendiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –20 °C gelagert bis zur weiteren Analyse. Die Proteinkonzentration von 1:3- und 1:10-Verdünnungen wurde durch BCA-Assay (Nr. 23227, Thermo Scientific) in Duplikaten gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. 10 µg Protein wurden in RIPA-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 15 µL verdünnt (12 µL + 3 µL 5xLane-Marker-reduzierender Probenpuffer (#39000, Thermo Scientific)). Die Proben wurden 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzt und neben der vorgefärbten Proteinleiter (PageRuler™ 10 bis 180 kDa, Nr. 26616, Thermo Scientific) auf ein 4–15 % vorgefertigtes Polyacrylamidgel (#4568086, BioRad) geladen. Die SDS-Seite wurde in 1× Laufpuffer bei 100 V für 5 Minuten und anschließend bei 85 V für 1,5 Stunden laufen gelassen (10× Laufpuffer: 0,25 M TRIS, 1,924 M Glycin, 0,03467 M SDS). Die Nitrozellulosemembran wurde 5 Minuten lang in Methanol aktiviert, in 1 × Transferpuffer gewaschen und ein halbtrockener Transfer wurde 22 Minuten lang bei 22 V durchgeführt (10 × Transferpuffer: 1,924 M Glycin, 0,25 M TRIS, 10 % MeOH). Der Blot wurde kurz in PBS-T gewaschen, 1 Stunde lang in 5 % Milch-PBS-T bei RT blockiert und mit Primärantikörper in 10 ml 5 % Milch in PBS-T über Nacht bei 4 °C inkubiert (Lgr5: ab75850, abcam 1:1000). Am nächsten Tag wurde der Blot 3 × 5 Minuten in PBS-T gewaschen, mit sekundärem Antikörper (#7074S, Cell Signaling 1:10.000) in 10 ml 5 %iger Milch in PBS-T 1 Stunde lang bei RT inkubiert und 3 × gewaschen 5 Minuten in PBS-T. Der Nachweis wurde mit dem SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (#34095, Thermo Scientific) durchgeführt. Die Chemilumineszenz wurde mit einem Chemidoc XRS+-System (BioRad) aufgezeichnet. Nach der Erkennung wurde der Blot kurz in PBS-T gewaschen, in 50 ml Stripping-Puffer (#21059, Thermo Scientific) bei 37 °C gestrippt, in PBS-T gewaschen und 1 Stunde lang in 5 % Milch-PBS-T erneut blockiert bei RT und erneut untersucht wie oben beschrieben (Gapdh: sc-32233, SantaCruz 1:8000, sekundär: #7076S, Cell Signaling 1:10.000).

Organoide wurden aus dem Matrigel extrahiert, indem Protease K (800 U, ~ 20 µg) hinzugefügt, die Lösung 5 Minuten lang bei 500 rcf zentrifugiert und der Überstand verworfen wurde. Die Gesamt-DNA (~ 1 µg/Probe) wurde mit einem QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen Katalog-Nr. 56304) extrahiert. Die Bibliotheksvorbereitung (350-bp-Inserts) und Sequenzierung (150-bp-PE) auf einer NovaSeq6000-Plattform (Illumina) wurde mit Novogene, Cambridge, UK durchgeführt. Rohlesevorgänge wurden gemäß der GATK4-Best-Practice-Empfehlung für die Datenvorverarbeitung zur Variantenerkennung verarbeitet. Die Lesevorgänge wurden dem Referenzgenom der mm10/GRCm38-Maus zugeordnet. Alle BAM-Dateien wurden mithilfe des DownsampleSam-Befehls von Picard Tools mit einer Genauigkeit von 0,001 heruntergesampelt, um der Datei mit der niedrigsten Abdeckung zu entsprechen. Varianten in organoiden Klonen wurden mit Mutect2 und Strelka2 aufgerufen, wobei die Schwanz-DNA als Referenz diente. In die Analyse wurden Varianten mit dem Filterstatus PASS einbezogen, die von beiden Tools aufgerufen wurden. Für jede Probe wurde die Verteilung der Varianten-Allel-Häufigkeit (VAF) aufgezeichnet. Alle Proben, die keine Verteilung um 0,5 aufwiesen, wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen.

Die De-novo-Mutationssignaturextraktion mit NMF wurde mit SigprofilerExtractor32 durchgeführt. Die Neuanpassung und Darstellung der Signatur wurde mit dem MutationalPatterns-Paket in R44 durchgeführt. Die Bootstrapping-Analyse der SNV-Signaturen wurde wie zuvor beschrieben24 durchgeführt. Kurz gesagt wurde Bootstrapped Resampling angewendet, um 10.000 Replikate der Mutationsmatrix für SD-Proben bzw. HFD-Proben zu generieren, wobei die zugrunde liegende Verteilung der Signaturen über die 96 Kanäle als Gewicht verwendet wurde. Die Ergebnisse wurden nach Ernährungsgruppe aggregiert, um ein durchschnittliches Bootstrapping-Mutationsprofil zu erstellen, das dann mithilfe der Kosinusähnlichkeit zwischen den Gruppen verglichen wurde.

Der gesamte Code, der zur Analyse der Daten und zur Erstellung der Zahlen verwendet wird, ist unter https://github.com/menchelab/hfd-mutagenesis verfügbar.

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Die Autoren danken den Mitgliedern des Koo-Labors für die Weitergabe ihres Know-hows über Organoidtechnologie und den Mitgliedern des Menche-Labors und des Loizou-Labors für ihre kritische Überarbeitung des Manuskripts. Wir möchten Dr. Núria López-Bigas und Dr. Abel Gonzalez-Perez (Institut für biomedizinische Forschung, Barcelona, Spanien) für hilfreiche Diskussionen und Feedback danken.

MM wurde durch ein DOC-Stipendium der Österreichischen Akademie der Wissenschaften (25757, verliehen an MM) unterstützt. Das Loizou-Labor wurde durch einen ERC Synergy Grant (DDREAMM Grant Agreement ID: 855741, vergeben an JIL) und den Österreichischen Wissenschaftsfonds (F79 Spezialforschungsbereiche, vergeben an JIL) finanziert. CeMM wird von der Österreichischen Akademie der Wissenschaften gefördert.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Mathilde Meyenberg und Anna Hakobyan.

CeMM Forschungszentrum für Molekulare Medizin der Österreichischen Akademie der Wissenschaften, 1090, Wien, Österreich

Mathilde Meyenberg, Anna Hakobyan, Franziska L. Langner, Georg A. Busslinger, Jörg Menche & Joanna I. Loizou

Zentrum für Krebsforschung, Comprehensive Cancer Center, Medizinische Universität Wien, 1090, Wien, Österreich

Mathilde Meyenberg & Joanna I. Loizou

Abteilung für Struktur- und Computerbiologie, Max Perutz Labs, Universität Wien, 1030, Wien, Österreich

Mathilde Meyenberg, Anna Hakobyan & Jörg Menche

Abteilung für Laboratoriumsmedizin, Medizinische Universität Wien, 1090, Wien, Österreich

Nikolina Papac-Milicevic, Laura Göderle, Mateo Markovic & Christoph J. Binder

Abteilung für Gastroenterologie und Hepatologie, Abteilung für Innere Medizin III, Medizinische Universität Wien, 1090, Wien, Österreich

Franziska L. Langner & Georg A. Busslinger

Institut für Molekulare Biotechnologie der Österreichischen Akademie der Wissenschaften (IMBA), Vienna BioCenter (VBC), Dr. Bohr-Gas 3, 1030, Wien, Österreich

Ji-Hyun Lee & Bon-Kyoung Koo

Zentrum für Genome Engineering, Institut für Grundlagenwissenschaften, 55, Expo-Ro, Yuseong-Gu, Daejeon, 34126, Republik Korea

Ji-Hyun Lee & Bon-Kyoung Koo

Labor für Computerbiologie und Bioinformatik, AC Camargo Cancer Center, São Paulo, 01508-010, Brasilien

Israel Tojal da Silva

Fakultät für Mathematik, Universität Wien, 1090, Wien, Österreich

Jörg Menche

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MM, AH, JM, BKK, CB und JIL konzipierten die Experimente, MM, NPM, LG und Mateo M. führten die Experimente durch, MM, AH, ITS und JM analysierten die Ergebnisse. MM, FLL und GAB konzipierten, führten und analysierten Revisionsexperimente. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Jörg Menche oder Joanna I. Loizou.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte. JIL ist derzeit Mitarbeiter von AstraZeneca.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Meyenberg, M., Hakobyan, A., Papac-Milicevic, N. et al. Mutationslandschaft von Darmkryptazellen nach langfristiger In-vivo-Exposition gegenüber fettreicher Ernährung. Sci Rep 13, 13964 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41123-3

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Eingegangen: 15. Januar 2023

Angenommen: 22. August 2023

Veröffentlicht: 26. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41123-3

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Mutationslandschaft von Darmkryptazellen nach langer Zeit