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Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 5021 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bei Wirbellosen, Nagetieren und Menschen nimmt die Proteintranslation (PT) mit zunehmendem Alter ab. Man geht davon aus, dass ein erhöhter PT in jungen Jahren gesundheitsfördernd ist und der PT letztendlich als passives Nebenprodukt des Alterns sinkt. Bei Drosophila zeigen wir, dass ein vorübergehender Anstieg der PT im frühen Erwachsenenalter langanhaltende negative Auswirkungen auf den Alterungsverlauf und die Proteostase im späteren Leben hat. Die Blockierung der PT-Erhöhung im frühen Leben verbessert deutlich die Lebens-/Gesundheitsspanne und verhindert altersbedingte Proteinaggregation, wohingegen die vorübergehende Auslösung eines PT-Anstiegs im frühen Leben bei langlebigen Fliegenstämmen deren Langlebigkeits-/Proteostasevorteile zunichte macht. Die frühe PT-Erhöhung löst eine proteostatische Dysfunktion aus, unterdrückt Stressreaktionen und treibt über die Juvenilhormon-Lipid-Transferprotein-Achse und die Keimbahnsignalisierung einen altersbedingten Funktionsabfall voran. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass PT nach dem frühen Erwachsenenalter adaptiv unterdrückt wird, was die proteostatische Belastung im späteren Leben lindert, den altersbedingten Funktionsverlust verlangsamt und die Lebensdauer verlängert. Unsere Arbeit bietet einen theoretischen Rahmen für das Verständnis, wie die PT-Dynamik über die gesamte Lebensdauer zukünftige Alterungsverläufe beeinflusst.

Die Proteintranslation (PT) ist ein wesentlicher zellulärer Prozess, der eine Schlüsselrolle bei Wachstum und Entwicklung spielt. PT tritt in jungen Jahren in hohem Maße auf, nimmt dann aber steil ab und bleibt im mittleren Alter bei mehreren Tierarten, darunter auch beim Menschen, niedrig1,2,3,4,5,6. Man könnte erwarten, dass eine Senkung des PT gesundheitsschädlich wäre, da sie zu einem Mangel an wichtigen zellulären Proteinen und einem langsameren Proteinumsatz führen könnte, wodurch sich mehr Proteinschäden ansammeln könnten. Es wurde jedoch berichtet, dass eine lebenslange Verringerung der PT altersbedingte Funktionseinbußen verlangsamt, die Lebensdauer verlängert7,8,9,10 und zelluläre Seneszenz und altersbedingte Krankheiten lindert11,12,13,14,15,16. Wir stellen fest, dass der PT bei allen Tierarten im frühen Erwachsenenalter erhöht ist1,2,3,4,5,6, was bedeutet, dass eine lebenslange PT-Unterdrückung dieses kritische Zeitfenster am stärksten beeinflussen würde, um die Langlebigkeit zu fördern. Dennoch wird allgemein angenommen, dass ein hoher PT in jungen Jahren gesundheitsfördernd ist, während der PT im Laufe der Zeit als passives Nebenprodukt des Alterns abfällt. Ob dies zutrifft und wie sich dynamische Schwankungen des PT im Laufe der Zeit auf das Altern auswirken, ist unbekannt. Wir haben daher PT in verschiedenen Lebensstadien bei Drosophila vorübergehend verändert und untersucht, wie sich diese Veränderungen auf die Alterungsphänotypen auswirken.

Wir stellen fest, dass die vorübergehende PT-Erhöhung im frühen Erwachsenenalter die Proteinhomöostase (Proteostase) spät im Leben stört, eine altersbedingte Proteinaggregation auslöst und altersbedingte Rückgänge verursacht. Unsere Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass der rasche Abfall des PT nach dem frühen Erwachsenenalter entscheidend für die Verringerung der proteostatischen Belastung, die Verlangsamung des altersbedingten Rückgangs und die Verbesserung der Lebens-/Gesundheitsspanne ist. Dies deutet darauf hin, dass der altersbedingte Rückgang der PT nicht nur ein passives Nebenprodukt des Alterns ist, sondern auch dazu beitragen kann, ein gesundes Altern zu fördern. Unsere Arbeit bietet einen theoretischen Rahmen für das Verständnis, wie die lebenslange PT-Dynamik zukünftige Alterungsverläufe und das Proteostase-Netzwerk beeinflusst.

Bei beiden Geschlechtern von Drosophila melanogaster beobachteten wir eine PT-Erhöhung im frühen Erwachsenenalter (Abb. 1a weiblich, ergänzende Abb. 1a männlich). Der PT erhöhte sich vom Tag 0 bis zum Tag 2 um das etwa Fünffache und sank danach deutlich ab. Diese Beobachtung stimmte mit drei unabhängigen Methoden überein: 35S-Methion-Einbau (Abb. 1a, links), Puromycin-Einbau (Abb. 1a, Mitte) und In-vitro-Luciferase-mRNA-Reporter-Assay (Abb. 1a, rechts). Der letztere Test misst die Fähigkeit von Lysaten, eingeführte Luciferase-mRNA17 zu translatieren. Der Luciferase-Assay wurde daher verwendet, um zu bestätigen, dass ein niedriger PT am Tag 0 kein Artefakt der Fütterung markierter Substrate an neu geschlüpfte Fliegen war, die möglicherweise von Larven erworbene Aminosäuren für PT verwenden. Um den Einfluss des PT-Anstiegs im frühen Leben auf die Alterungsphänotypen zu untersuchen, unterdrückten wir die PT im frühen Erwachsenenalter (Tag 0–10) vorübergehend mit einem weit verbreiteten PT-Inhibitor (Cycloheximid, CHX) (Abb. 1b). Wir haben Fliegen auch im späten Erwachsenenalter (Tag 40–50) und während des gesamten Erwachsenenlebens mit CHX gefüttert (Abb. 1c). In Übereinstimmung mit früheren Studien verlängerte die CHX-Behandlung während des gesamten Erwachsenenlebens die Lebensspanne deutlich. Überraschenderweise führte die CHX-Behandlung nur in den ersten 10 Tagen des Erwachsenenlebens zu einer ähnlichen Verlängerung der Lebensspanne (Abb. 1d). Eine CHX-Behandlung im späten Lebensalter verlängerte die Lebensdauer jedoch nicht (Abb. 1d, ergänzende Abb. 1b). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die vorübergehende PT-Erhöhung im frühen Erwachsenenalter ein wichtiger Faktor für das Altern sein könnte.

ein PT über das Alter hinweg, bestimmt durch (links) 35S-Methionin-Einbau, normalisiert auf den Proteingehalt (n = 3) und (Mitte) Puromycin-Einbau, normalisiert auf Ponceau-Färbung (n = 3). Die Analysen vergleichen die PT relativ zu Tag 2; einfaktorielle ANOVA mit Dunnetts Post-hoc-Test. (Rechts) In-vitro-PT-Assay mit Luciferase-mRNA-Reporter und Fliegenextrakten. Die Steigung des linearen Teils der Luciferase-Aktivitätskurve wird zur Berechnung der PT-Rate verwendet. n = 12/Gruppe; einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test. b PT im frühen Erwachsenenalter nach ± ​​1 µM CHX (Tag 0–10), bestimmt durch Puromycin-Einbau, normalisiert auf Ponceau-Färbung. n = 3/Gruppe; Zweifaktorielle ANOVA mit Sidak-Korrektur. c Experimentelles Schema zur vorübergehenden Manipulation von PT in verschiedenen Lebensphasen; 1 µM Cyclohexamid (CHX), verabreicht an w1118-Fliegen im frühen Erwachsenenalter (Tag 0–10), im späten Erwachsenenalter (Tag 40–50) oder im gesamten Erwachsenenalter. d Frühes Erwachsenenalter (Tag 0–10) CHX verlängert die Lebensspanne genauso wie CHX im gesamten Erwachsenenalter. Im späten Erwachsenenalter (Tag 40–50) verändert CHX die Lebensspanne nicht. Jedes Geschlecht: n = 250/Gruppe; Log-Rank-Test. e Im frühen Erwachsenenalter (Tag 0–10) CHX reduziert altersbedingte Defizite in der Spontanaktivität. Jung=Tag 12, alt=Tag 50. n = 200/Gruppe; Zweifaktorielle ANOVA mit Sidak-Korrektur. f Im frühen Erwachsenenalter (Tag 0–10) CHX reduziert altersbedingte kognitive Defizite beim Training der Geruchsaversion. Jung=Tag 12, alt=Tag 50. n = 200/Gruppe; Chi-Quadrat-Test. g Frühes Erwachsenenalter (Tag 0–10) CHX verhindert altersbedingte Defizite bei der Integrität der Darmbarriere in Smurf-Assays. n = 250/Gruppe; Zweifaktorielle ANOVA mit Sidak-Korrektur. h (Links) repräsentative Bilder von auf Fläschchen gelegten Eiern nach CHX-Behandlungen im frühen Erwachsenenalter (Tag 0–10). (Rechts) CHX im frühen Erwachsenenalter beeinträchtigt die Eiproduktion in jungen Jahren, verzögert den Höhepunkt der Fruchtbarkeit und verbessert die Eiproduktion im Alter. n = 100/Gruppe; Zweifaktorielle ANOVA mit Sidak-Korrektur. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt. Hier werden weibliche Daten für PT-Assays und Healthspan-Assays angezeigt. Männliche Daten in ergänzender Abbildung 1. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Auch die Gesundheitsspanne verbesserte sich erheblich, nachdem die PT-Erhöhung im frühen Erwachsenenalter verhindert wurde. Bei beiden Geschlechtern beseitigte die CHX-Behandlung im frühen Erwachsenenalter den normalen altersbedingten Rückgang der spontanen Aktivität (Abb. 1e weiblich, ergänzende Abb. 1c männlich) sowie des Lernens und des Gedächtnisses (Abb. 1f weiblich, ergänzende Abb. 1d männlich). Die kognitive Funktion wurde bei Fliegen mit einem etablierten Paradigma für das Training der olfaktorischen Aversion beurteilt, bei dem Fliegen darauf trainiert wird, einen bestimmten Geruch mit einer negativen Empfindung (Elektroschock) zu assoziieren18. Wir haben bestätigt, dass dieses Ergebnis kein Artefakt einer CHX-Behandlung im frühen Leben war, die die sensomotorischen Reaktionen auf Gerüche und Stromschläge im Alter beeinflusste (ergänzende Abbildung 1f). Darüber hinaus haben wir die Darmgesundheit, insbesondere die Funktion der Darmbarriere, mit dem sogenannten „Smurf“-Assay19 untersucht. Hier wurde den Fliegen ein nicht resorbierbarer blauer Farbstoff verabreicht, und der Verlust der Integrität der Darmbarriere wurde durch Zählen der Anzahl der Fliegen festgestellt, die außerhalb des Verdauungstrakts und im gesamten Körper blauen Farbstoff aufwiesen (sogenannte „Schlümpfe“). Eine CHX-Behandlung im frühen Lebensalter verhinderte vollständig eine altersabhängige Zunahme der Schlümpfe und verbesserte die Integrität der Darmbarriere im Alter bei beiden Geschlechtern drastisch (Abb. 1g weiblich, ergänzende Abb. 1e männlich). Eine CHX-Behandlung im frühen Leben verhinderte auch die Seneszenz der Fortpflanzung und steigerte die Eiproduktion im Alter deutlich (Abb. 1h); Allerdings war die Eiproduktion im frühen Erwachsenenalter beeinträchtigt und der Fruchtbarkeitsgipfel verzögerte sich. Diese Ergebnisse deuten auf einen möglichen Kompromiss zwischen Fruchtbarkeit im frühen Erwachsenenalter und späterer Gesundheit und Langlebigkeit hin. Wie bereits bei Linien beobachtet, die für das Überleben ausgewählt wurden, um sich im späten Lebensalter fortzupflanzen20, ist die Fortpflanzung im frühen Lebensalter verringert, während die Fortpflanzung im späten Lebensalter verbessert ist. Dennoch wurde die gesamte lebenslange Eierproduktion nicht wesentlich beeinträchtigt (ergänzende Abbildung 1h). Zusammenfassend deuten unsere Daten darauf hin, dass eine PT-Erhöhung im frühen Erwachsenenalter zwar vorteilhaft für die Maximierung der Fruchtbarkeit im frühen Leben ist, sich aber langfristig negativ auf die Alterungsverläufe im späteren Leben auswirkt.

Ribosomale S6-Kinase (S6K) fördert PT durch Phosphorylierung/Aktivierung der Translationsmaschinerie21. Er stellte die Hypothese auf, dass während der PT-Erhöhung im frühen Erwachsenenalter die S6K-Phosphorylierung erhöht sein wird. Wir haben daher eine dominant-negative/Kinase-tote Form von S6K (S6KKQ)22 im frühen Erwachsenenalter mithilfe des GeneSwitch-Systems (RU486-induzierbare Expression) überexprimiert, das den frühen Anstieg der PT vollständig blockierte (Abb. 2a, b). Die Ergebnisse waren unseren CHX-Experimenten bemerkenswert ähnlich. Die Überexpression von S6KKQ im frühen Erwachsenenalter verlängerte die Lebenserwartung in ähnlichem Maße wie die Überexpression von S6KKQ im gesamten Erwachsenenalter (Abb. 2c). Darüber hinaus verbesserte die Überexpression von S6KKQ im frühen Erwachsenenalter auch die Bewegungsaktivität, die kognitive Funktion, die Integrität der Darmbarriere und die Fortpflanzungsleistung im Alter bei beiden Geschlechtern (ergänzende Abbildung 2a – g, i, j). Wie bei unseren CHX-Behandlungen veränderte die Überexpression von S6KKQ im späten Erwachsenenalter jedoch die Lebensdauer nicht wesentlich (Abb. 2c, ergänzende Abb. 2k). Der induzierende Wirkstoff RU486 hatte keinen Einfluss auf unsere experimentellen Endpunkte. Insbesondere veränderte RU486 selbst die Lebensdauer in keinem Erwachsenenstadium bei tochterlosen GeneSwitch GAL4 (daGS)>w1118 (Kontroll)-Fliegen signifikant (ergänzende Abbildung 2l). Auch für daGS > w1118 hatte RU486 keinen signifikanten Einfluss auf die Eiproduktion über das Alter hinweg (ergänzende Abbildung 2h), was darauf hindeutet, dass RU486 selbst den Fruchtbarkeitsgipfel nicht verzögerte oder die Fortpflanzungsfähigkeit im Alter nicht verbesserte.

a PT im frühen Erwachsenenalter in daGS > UAS-S6KKQ fliegt nach ± ​​200 µM RU486 (Tag 0–10), bestimmt durch Puromycin-Einbau, normalisiert auf Ponceau-Färbung. n = 3/Gruppe; Zweifaktorielle ANOVA mit Sidak-Post-hoc-Test. b Experimentelles Schema zur vorübergehenden Manipulation von PT in verschiedenen Lebensphasen; 200 µM RU486, verabreicht an tochterlosen GeneSwitch GAL4 (daGS)>UAS-S6KKQ, fliegt im frühen Erwachsenenalter (Tag 0–10), im späten Erwachsenenalter (Tag 40–50) oder im gesamten Erwachsenenalter. c In daGS > UAS-S6KKQ fliegt im frühen Erwachsenenalter (Tag 0–10). RU486 verlängert die Lebensdauer genau wie RU486 im gesamten Erwachsenenalter. Im späten Erwachsenenalter (Tag 40–50) verändert RU486 die Lebenserwartung nicht. Jedes Geschlecht: n = 250/Gruppe; Log-Rank-Test. Puromycin-Einbau in (d), Chico-Homozygoten (weiblich) und (e), Chico-Heterozygoten (weiblich) vs. Wildtypen. Fehlen einer PT-Erhöhung im frühen Erwachsenenalter bei Chico-Homozygoten und Chico-Heterozygoten. n = 3/Gruppe; Zweifaktorielle ANOVA mit Sidak-Post-hoc-Test. Männliche Daten in der ergänzenden Abbildung 1. f Experimentelles Schema zur Induktion der PT-Erhöhung im frühen Erwachsenenalter bei Chico-Homozygoten; ± 200 µM RU486 gegeben an chico1/chico1, UAS-S6KTE; tubulin-GeneSwitch (tubGS) GAL4 fliegt im frühen Erwachsenenalter (Tag 0–4). g Puromycin-Einbau in chico1/chico1, UAS-S6KTE; tubGS GAL4 fliegt (±RU486, Tag 0–4). n = 3/Gruppe; Zweifaktorielle ANOVA mit Sidak-Post-hoc-Test. h Die Überexpression von S6KTE im frühen Erwachsenenalter verkürzt die Lebensdauer und hebt die Langlebigkeit von Chico-Homozygoten weitgehend auf. Chico fliegt ohne S6KTE-Induktionen im frühen Erwachsenenalter im Vergleich zu Kontrollen. Frauen: + 34,4 %, Männer: + 37,7 % (prozentuale Veränderung der mittleren Lebenserwartung); Chico fliegt mit S6KTE-Induktionen im frühen Erwachsenenalter im Vergleich zu Kontrollen. Frauen: + 6,3 %, Männer: + 8,2 %. Die S6KTE-Überexpression im frühen Erwachsenenalter verändert die Lebensdauer der +/+-Kontrollen nicht wesentlich. Jedes Geschlecht: n = 250/Gruppe; Log-Rank-Test. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um weiter zu bestätigen, dass unsere Ergebnisse nicht auf Off-Target-Wirkungen von CHX zurückzuführen sind, verwendeten wir Diazaborin (DAB) als unsere dritte Methode, um die PT-Erhöhung im frühen Erwachsenenalter zu verhindern (ergänzende Abbildung 1i, j). Es ist bekannt, dass DAB PT unterdrückt, indem es die rRNA-Reifung und die ribosomale Biogenese blockiert8,23. In Übereinstimmung mit unseren früheren Erkenntnissen verlängerte die DAB-Behandlung im frühen Erwachsenenalter die Lebensspanne in ähnlichem Ausmaß wie die lebenslange Behandlung signifikant, ohne dass es bei der Behandlung im späten Erwachsenenalter zu Auswirkungen auf die Langlebigkeit kam (ergänzende Abbildung 1k).

Die Vorteile für die Lebens-/Gesundheitsspanne durch die Blockierung der PT-Erhöhung im frühen Erwachsenenalter waren nicht auf eine Ernährungseinschränkung zurückzuführen. Weder die CHX-Behandlung im frühen Leben noch die Überexpression von S6KKQ im frühen Leben hatten signifikante Auswirkungen auf die Nahrungsaufnahme und die Speicherung von Triglyceriden / Glykogen über das Alter hinweg (ergänzende Abbildung 3d – i). Interventionen im frühen Erwachsenenalter hatten auch keine signifikanten Auswirkungen auf die Körpergröße und die Größe innerer Organe wie Muskeln, Darm oder Fettkörper (ergänzende Abbildung 3a–c). Im Gegensatz zu Männern hatten Frauen, die früh im Leben mit CHX/RU486 behandelt wurden, ein geringeres Körpergewicht, obwohl sie nicht weniger aßen (ergänzende Abbildung 3j, k), möglicherweise aufgrund einer beeinträchtigten Eiproduktion im frühen Erwachsenenalter. Da jedoch die Blockierung des frühen Anstiegs der PT die Lebensspanne bei beiden Geschlechtern und nicht nur bei Frauen erheblich verlängerte, ist es unwahrscheinlich, dass ein verringertes Körpergewicht allein ein wesentlicher Faktor für die verlängerte Lebensspanne ist.

Die Insulin/IGF-Signalübertragung ist ein wichtiger Wachstumsregulationsweg, dessen Hemmung die Lebensdauer deutlich verlängert und altersbedingte Krankheiten bei mehreren Tierarten verzögert24. Wir untersuchten, wie sich die PT-Dynamik bei Zwergfliegen (Chico-Homozygoten) mit Insulin/IGF-Signalmangel verändert. Es wurde gezeigt, dass Mutationen in Chico, dem Drosophila-Homolog des Insulinrezeptorsubstrats (IRS) von Wirbeltieren, die Lebens-/Gesundheitsspanne verlängern und vor Neurodegeneration schützen25,26,27. Langlebige Chico-Homozygoten beiderlei Geschlechts zeigten im Gegensatz zu Wildtyp-Gegenstücken keine PT-Erhöhung im frühen Erwachsenenalter (Abb. 2d, ergänzende Abb. 1l). Interessanterweise zeigten Chico-Heterozygoten, die ebenfalls langlebig sind, aber keine Zwergwuchs-Phänotypen aufweisen, die bei Chico-Homozygoten zu beobachten sind, ebenfalls keine PT-Erhöhung im frühen Leben (Abb. 2e, ergänzende Abb. 1m). Daher ist der Verlust der PT-Erhöhung im frühen Erwachsenenalter bei langlebigen Chico-Fliegen unabhängig von Zwergphänotypen.

Um zu untersuchen, ob Chico-Homozygoten eine lange Lebensdauer erreichen, indem sie den Anstieg der PT im frühen Erwachsenenalter verhindern, haben wir experimentell die PT-Erhöhung im frühen Leben durch vorübergehende Überexpression einer konstitutiv aktiven Form von S6K (S6KTE)28 im frühen Erwachsenenalter (Tag 0–4) induziert ) mit RU486 (Abb. 2f). Wir haben S6K mit einer phosphomimetischen T398E-Mutation überexprimiert, da die S6K-Phosphorylierung bei T398 im frühen Erwachsenenalter erhöht war (Abb. 3a) und für die PT-Erhöhung im frühen Leben von entscheidender Bedeutung war. Unmittelbar nach der Entfernung von RU486 wurde der PT verringert und auf das Grundniveau wiederhergestellt (Abb. 2g), was darauf hindeutet, dass wir den PT vorübergehend so manipulieren konnten, dass er nur während des engen Zeitfensters des frühen Erwachsenenalters erhöht wurde. Chico-Homozygoten hatten eine deutlich verbesserte Lebensdauer; Allerdings verkürzte die Überexpression von S6KTE für nur 4 Tage ihre Lebensdauer erheblich gegenüber der der Kontrollen und machte ihre Langlebigkeitsvorteile weitgehend zunichte (Abb. 2h). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Verlust der vorübergehenden PT-Erhöhung im frühen Leben entscheidend für die Langlebigkeit von Chicofliegen ist.

a Immunoblots von Phospho-S6K und S6K. Als Ladungskontrolle wurde Actin verwendet. n = 3; einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test. b Einbau von Puromycin in daGS > UAS-S6KTE-Fliegen (±RU486 nach Tag 2). n = 3/Gruppe; Zweifaktorielle ANOVA mit Sidak-Korrektur. c Experimentelles Schema zur Blockierung des altersbedingten Rückgangs der PT; 200 µM RU486, 200 µM RU486 + 1 µM CHX oder Vehikel, gegeben an Daughterless-GeneSwitch GAL4 (daGS)>UAS-S6KTE fliegt nach Tag 2 (dem PT-Höhepunkt). d S6KTE-Überexpression nach Tag 2 verkürzt die Lebenserwartung (: −41,8 %, männlich: −45,6 %; prozentuale Veränderung der mittleren Lebenserwartung), aber die gleichzeitige CHX-Behandlung stellt die Lebenserwartung wieder her, die mit der der Kontrollen vergleichbar ist. Jedes Geschlecht: n = 250/Gruppe; Log-Rank-Test. e S6KTE-Überexpression nach Tag 2 beeinträchtigt die Fortbewegung am Tag 40. n = 200 Frauen/Gruppe; Zweifaktorielle ANOVA mit Sidak-Korrektur. f Die Überexpression von S6KTE nach Tag 2 führt in Smurf-Assays zu vorzeitigen Defekten der Integrität der Darmbarriere. n = 250 Frauen/Gruppe; Zweifaktorielle ANOVA mit Sidak-Korrektur. g S6KTE-Überexpression nach Tag 2 beeinträchtigt die Wahrnehmung im Geruchsaversionstraining am Tag 40. n = 200 Frauen/Gruppe; Chi-Quadrat-Test. h (Links) repräsentative Bilder von Eiern, die am 30. Tag von daGS auf Fläschchen gelegt wurden > UAS-S6KTE-Fliegen und daGS > w1118 (Kontrolle) Fliegen, die nach Tag 2 mit ± RU486 behandelt wurden. (Mitte) S6KTE-Überexpression nach Tag 2 führt zu einer schnelleren altersbedingten Entwicklung Rückgang der Eierproduktion. n = 100/Gruppe; Zweifaktorielle ANOVA mit Sidak-Korrektur. (Rechts) Die Fläche unter der Kurve wurde berechnet, um die lebenslange Eierproduktion zu bestimmen. Eine S6KTE-Überexpression nach Tag 2 beeinträchtigt die lebenslange Eiproduktion. Zweiseitiger Student-T-Test. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Daten zur männlichen Gesundheitsspanne in der ergänzenden Abbildung 4. Die Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Insgesamt deuten unsere Ergebnisse stark darauf hin, dass die Erhöhung der PT im frühen Erwachsenenalter zu altersbedingten Funktionseinbußen führen kann. Wir gehen davon aus, dass die Unterdrückung von PT ab Tag 2 ein adaptiver Prozess zur Reduzierung der proteostatischen Belastung und zur Verlangsamung des altersbedingten Funktionsabfalls ist. Wir fanden heraus, dass die T398-Phosphorylierung von S6K nach Erreichen eines Höhepunkts am Tag 2 stark abnimmt und am Tag 15 niedrige Grundwerte beibehält (Abb. 3a). Dies impliziert, dass der altersbedingte Rückgang der PT möglicherweise auf den Verlust der S6K-Phosphorylierung bei T398 zurückzuführen ist. Um unsere Hypothese zu bewerten, verhinderten wir daher den altersabhängigen Rückgang der PT durch Überexpression des Phosphomimetika S6KTE ab Tag 2. Bei Kontrollfliegen verringerte sich die PT innerhalb von 15 Tagen um ~70 %, aber Fliegen, die S6KTE überexprimierten, reduzierten die PT danach nicht signifikant den Höhepunkt und behielt hohe PT-Werte bei (Abb. 3b). Die Verhinderung des altersbedingten Abfalls der PT verkürzte die Lebensspanne bei beiden Geschlechtern um ca. 46 % (Abb. 3c, d). Durch die erneute Aktivierung der PT-Werte der Fliegen mit zunehmendem Alter nach dem frühen Erwachsenenalter und die Korrektur der PT-Dynamik über CHX (Abb. 3c, ergänzende Abb. 4a) wurde die Lebensdauer jedoch vollständig auf das Kontrollniveau zurückgeführt (Abb. 3d). Die Unfähigkeit, PT nach dem frühen Erwachsenenalter zu unterdrücken, verkürzte auch die Gesundheitsspanne bei beiden Geschlechtern erheblich. Selbst im mittleren Alter zeigten Fliegen, die S6KTE nach dem PT-Peak überexprimierten, eine Verschlechterung der spontanen Aktivität (Abb. 3e, ergänzende Abb. 4b), der Darmintegrität (Abb. 3f, ergänzende Abb. 4f), des Lernens und des Gedächtnisses (Abb. 3g, ergänzende Abb. 4b). Abb. 4c–e) und Anzeichen einer beschleunigten reproduktiven Alterung, wobei die gesamte Eiproduktion um ~50 % zurückging (Abb. 3h). Im Gegensatz dazu zeigten Kontrollfliegen zu diesem Zeitpunkt kaum funktionelle Beeinträchtigungen. Zusammengenommen deuten unsere Daten darauf hin, dass der altersbedingte Rückgang der PT möglicherweise nicht nur ein passives Nebenprodukt des Alterns ist, sondern möglicherweise eine adaptive Reaktion zur Maximierung der Reproduktionsleistung, zur Verlangsamung des funktionellen Rückgangs und zur Förderung eines gesunden Alterns.

Mit zunehmendem Alter verschlechtert sich die Proteostase, was zu Ansammlungen von fehlgefalteten Proteinen und unlöslichen Proteinaggregaten führt, die stark mit dem Altern und altersbedingten Krankheiten in Zusammenhang stehen29. Wir gehen davon aus, dass der PT-Anstieg im frühen Erwachsenenalter und die anschließende Proteinüberladung die zelluläre Faltungskapazität überfordern, was eine Proteinfehlfaltung begünstigt und die Proteostase beeinträchtigt. Um zu untersuchen, ob die PT-Erhöhung im frühen Erwachsenenalter eine altersabhängige proteostatische Dysfunktion auslöst, behandelten wir Fliegen im frühen Erwachsenenalter mit CHX und untersuchten den Aufbau unlöslicher Proteinaggregate über das Alter hinweg. Bemerkenswerterweise verhinderte die vorübergehende Blockierung der Erhöhung der PT im frühen Erwachsenenalter die altersbedingte Anreicherung von unlöslichen ubiquitinierten Proteinen (IUP) vollständig (Abb. 4a). Im Gegensatz dazu zeigten langlebige Chico-Homozygoten, die ihr ganzes Leben lang ein konstantes PT-Niveau aufrechterhalten, keine Anzeichen einer altersabhängigen IUP-Akkumulation. Die vorübergehende Induktion der PT-Erhöhung im frühen Leben führte jedoch dazu, dass Chico-Homozygoten genau wie Wildtypen eine altersbedingte Anhäufung von IUP aufwiesen (Abb. 4b). Dies steht im Einklang mit unserer früheren Feststellung, dass die Auslösung des PT-Anstiegs im frühen Erwachsenenalter die Lebensdauer von Chico-Homozygoten im Vergleich zu den Kontrollpersonen verkürzte. Zusammengenommen deuten unsere Daten darauf hin, dass der vorübergehende Anstieg der PT im frühen Erwachsenenalter eine IUP-Akkumulation im Alter auslöst.

Frühes Erwachsenenalter = Tag 0–10. a Im frühen Erwachsenenalter verhindert 1 µM CHX die altersbedingte Bildung unlöslicher ubiquitinierter Proteine ​​(IUP). n = 3/Gruppe; Zweifaktorielle ANOVA mit Sidak-Korrektur. b Kein altersbedingter Aufbau von IUP bei langlebigen Chico-Homozygoten. Die Überexpression von S6KTE (Tag 0–4) führt bei Chico-Homozygoten zu einer altersbedingten Anhäufung von IUP. n = 3/Gruppe; Zweifaktorielle ANOVA mit Sidak-Korrektur. c Vulkandiagramme proteomischer Analysen zum Vergleich der löslichen Triton X-100-Fraktionen von Tag 2 mit Fliegen von Tag 0 (oben) und Fliegen von Tag 2 (±CHX, unten). n = 8/Gruppe; zweiseitiger Student-t-Test, FDR < 0,05. d Vulkandiagramm der Proteomanalyse zum Vergleich der unlöslichen Triton X-100-Fraktionen von Fliegen am 50. Tag (± CHX (Tag 0–10)). n = 8/Gruppe; zweiseitiger Student-t-Test, FDR < 0,05. e (Links) Juvenilhormonspiegel, gemessen mittels GC-MS, normalisiert auf die Nassmasse bei Fliegen am Tag 0 und Fliegen am Tag 2, die mit Vehikel oder CHX behandelt wurden. n = 25/Gruppe. (Rechts) CHX im frühen Erwachsenenalter verhindert die Bildung von IUP am 50. Tag; CHX+Met (Methopren, 25 µg/ml) im frühen Erwachsenenalter führt jedoch genau wie die Kontrollen am Tag 50 zum Aufbau von IUP. n = 3/Gruppe; Zweifaktorielle ANOVA mit Sidak-Korrektur. f Met im frühen Erwachsenenalter (25 µg/ml) beseitigt die CHX-vermittelte Langlebigkeit weitgehend (weiblich: + 6,1 % vs. + 36,7 %, männlich: + 7,7 % vs. + 34,6 %; prozentuale Veränderung der mittleren Lebensspanne, p < 0,0001) . Met allein im frühen Erwachsenenalter verkürzt die Lebensspanne (p < 0,0001), aber der Effekt ist geringer als der, den wir bei gleichzeitiger CHX-Behandlung beobachten (proportionale Gefahrenanalyse in ergänzender Abbildung 6). Met im gesamten Erwachsenenalter verkürzt die Lebenserwartung (p < 0,0001). Jedes Geschlecht: n = 250/Gruppe; Log-Rank-Test. g: Die Verlängerung der Lebensspanne durch CHX im frühen Erwachsenenalter ist unter CA-Ablation (Corpora allata) verringert (weiblich: + 7,9 % vs. + 41,5 %, männlich: + 9,7 % vs. + 42,5 %). Kontrolle 1=Aug21-GAL4 > w1118; Steuerung 2 = w1118 > UAS-NiPp1; CA abgetragen=Aug21-GAL4 > UAS-NiPp1. Jedes Geschlecht: n = 250/Gruppe; Log-Rank-Test. Proportionale Gefahrenanalyse in der ergänzenden Abbildung 6. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wie in früheren C. elegans-Studien gezeigt wurde, handelt es sich insbesondere bei den meisten Proteinen, die unlösliche Proteinaggregate bilden, die während des Alterns gebildet werden, um Proteine, von denen bekannt ist, dass sie überwiegend im frühen Erwachsenenalter funktionieren30. Bei Drosophila gehen wir daher davon aus, dass aggregationsanfällige Proteine, die im frühen Erwachsenenalter unter hoher PT stark synthetisiert werden, eine altersabhängige proteostatische Dysfunktion auslösen können. Um diese Hypothese zu testen und Kandidaten für aggregationsanfällige Proteine ​​zu identifizieren, verwendeten wir Flüssigkeitschromatographie/Elektrospray-Ionisation-Tandem-Massenspektrometrie (LC/ESI-MS/MS). Wir untersuchten, wie sich die Blockierung der frühen Erhöhung der PT auf das im frühen Erwachsenenalter synthetisierte Proteom und dementsprechend auf die Bestandteile unlöslicher Proteinaggregate im Alter auswirkt.

Während des Anstiegs der PT im frühen Leben wurden große Familien von Lipidtransferproteinen (LLTP) wie Vitellogenin (Vg)-1, 2 und Apolipophorin (apoLp) in großem Umfang synthetisiert, zusammen mit Proteinen, die für den Lipid-/Kohlenhydratstoffwechsel, die ATP-Erzeugung und die Reproduktion wichtig sind /Gametogenese (Abb. 4c, Zusatzdaten 1). LLTP-Familien – Lipidtransferproteine, die bei allen Tierarten, einschließlich des Menschen, konserviert sind, spielen eine zentrale Rolle bei der Fortpflanzung und dem Energiestoffwechsel31. In der Zwischenzeit wurden für Larvenfettkörper charakteristische Proteine, wie Larvenserumproteine ​​(LSP1-α, β, γ und LSP-2) und Fettkörperproteine ​​(FBP-1,2), signifikant herunterreguliert (Abb. 4c, Ergänzende Daten 1). ). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Umbau von Lipoproteinen im frühen Erwachsenenalter stattfindet, um die Histolyse des Fettkörpers der Larven zu erleichtern und gleichzeitig den Fettkörper des Erwachsenen zu entwickeln, in dem LLTPs synthetisiert werden32,33. Die CHX-Behandlung im frühen Erwachsenenalter kehrte diesen Lipoprotein-Remodelling vollständig um, was sich in verringerten LLTP-Spiegeln, anhaltend hohen LSP/FBP-Spiegeln und einer signifikanten Beeinträchtigung des Lipidkatabolismus in der Genontologieanalyse äußerte (Abb. 4c, Ergänzende Daten 1, Ergänzende Abb. 5, 6a). , B). Die CHX-Behandlung im frühen Erwachsenenalter führte im Alter zu einer weitreichenden Verringerung unlöslicher Proteine, wobei LLTPs die am stärksten herunterregulierten Proteine ​​waren (Abb. 4d, Ergänzende Daten 1). Diese Ergebnisse zeigen, dass LLTPs, die im Alter zur Aggregation neigen, zunehmend synthetisiert werden, wenn PT im frühen Erwachsenenalter erhöht ist, während die CHX-Behandlung im frühen Erwachsenenalter dies blockiert.

Anders als bei unlöslichen Fraktionen verursachte die CHX-Behandlung im frühen Leben keine dramatischen Proteomveränderungen in den löslichen Fraktionen im Alter, mit Ausnahme einer Hochregulierung von Proteinen, die die Funktion von Muskeln, Herz und Entgiftung fördern (ergänzende Abbildung 7a). Die Überexpression dieser Proteine ​​​​hatte jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die Lebensdauer (ergänzende Abbildung 7b – d), was darauf hindeutet, dass diese Proteine ​​​​als Nebenprodukt und nicht als Treiber für gesundes Altern hochreguliert werden.

Wir stellen fest, dass Juvenilhormon (JH), das hauptsächlich in den Corpora allata (CA) synthetisiert wird, nicht nur die Histolyse des Fettkörpers der Larven fördert, sondern auch alle LLTP-Familien im frühen Erwachsenenalter hochreguliert33. Bei gezielter MS/MS stellten wir fest, dass die JH-Werte vom Tag 0 bis zum Tag 2 signifikant ansteigen, wenn die PT deutlich ansteigt (Abb. 4e). Dieser Anstieg des JH während einer erhöhten PT im frühen Erwachsenenalter wurde durch die CHX-Behandlung im frühen Erwachsenenalter verhindert. Bei langlebigen Chico-Homozygoten ohne erkennbare PT-Erhöhung im frühen Leben (Abb. 2) bleibt JH im frühen Erwachsenenalter auf niedrigen Basalwerten34. Wir untersuchten daher, ob die Erhöhung der PT im frühen Leben zu einer proteostatischen Dysfunktion und einem altersbedingten Funktionsabfall über JH führt. Überraschenderweise brachte die Blockierung der frühen PT-Erhöhung nach Methopren-Behandlungen (Met; JH-Analogon) im frühen Erwachsenenalter keine Vorteile mehr für die Proteostase im Alter (Abb. 4e). Met im frühen Erwachsenenalter hob auch die Langlebigkeitsvorteile weitgehend auf, die durch die Blockierung der frühen PT-Erhöhung erzielt wurden (Abb. 4f; Frauen: + 6,1 % gegenüber + 36,7 %, Männer: + 7,7 % gegenüber + 34,6 %). Met allein im frühen Erwachsenenalter verkürzte ebenfalls die Lebensspanne, aber die Zwei-Faktor-Proportional-Hazard-Analyse zeigte, dass der Effekt deutlich geringer war als der, den wir bei gleichzeitiger CHX-Behandlung beobachteten (ergänzende Abbildung 6c). In ähnlicher Weise war unter Bedingungen eines JH-Mangels (CA-Ablation)33 die Verlängerung der Lebensspanne durch CHX-Behandlung im frühen Erwachsenenalter deutlich verringert (Abb. 4g. Ergänzende Abb. 6d; weiblich: + 7,9 % vs. + 41,5 %, männlich: + 9,7). % vs. + 42,5 %). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass der frühe Anstieg der PT eine altersabhängige proteostatische Dysfunktion auslöst und das Altern hauptsächlich über JH vorantreibt.

Ein erhöhter Proteinumsatz durch proteasomalen Abbau kann die Proteostase und die Lebensdauer verbessern35. Die Blockierung der Erhöhung der PT im frühen Leben verlangsamte den altersbedingten Rückgang der Proteasomaktivität um 58 % (ergänzende Abbildung 7e). Dies kann auf eine selektive Hochregulierung der Proteasom-Untereinheiten36 oder auf verstärkte Proteasom-Anordnungen zurückzuführen sein, indem verhindert wird, dass Proteasom-Untereinheiten/ATP-erzeugende Maschinen in unlöslichen Fraktionen eingeschlossen werden (ergänzende Abbildung 6e). Aufgrund der tiefgreifenden Auswirkungen von JH im frühen Leben auf die Proteostase haben wir uns jedoch entschieden, uns auf die JH-Signalisierung zu konzentrieren.

Als nächstes untersuchten wir, ob LLTPs, die größtenteils während der Erhöhung der PT im frühen Erwachsenenalter synthetisiert werden, Ursachen für altersbedingte Rückgänge und proteostatische Dysfunktion im Alter sind. Nach der Überexpression von ApoLp im frühen Erwachsenenalter brachte die CHX-Behandlung im Alter keine Vorteile mehr für die Proteostase (Abb. 5a, ergänzende Abb. 7f). Ebenso wurden die Vorteile der CHX-Behandlung im frühen Leben nach der Überexpression von ApoLp im frühen Erwachsenenalter weitgehend aufgehoben (Abb. 5b; weiblich: + 10,9 % vs. + 45,5 %, männlich: + 8,2 % vs. + 44,3 %). Die Überexpression von ApoLp im frühen Erwachsenenalter allein verkürzte ebenfalls die Lebensdauer, aber die proportionale Gefahrenanalyse zeigte, dass der Effekt deutlich geringer war als der, den wir bei gleichzeitiger CHX-Behandlung beobachteten (ergänzende Abbildung 7g). In ähnlicher Weise führte die Überexpression von Vg im frühen Erwachsenenalter zu einer erheblichen Verbesserung der Proteostase/Lebensdauer, die durch die Blockierung des frühen Anstiegs der PT verursacht wurde (Abb. 5c, d, ergänzende Abb. 7f, g). Darüber hinaus verlängerte der Abbau von Vg und ApoLp im frühen Erwachsenenalter die Lebensdauer bei Kontrollfliegen erheblich, nicht jedoch bei Fliegen, die im frühen Leben mit CHX behandelt wurden (ergänzende Abbildung 7h – j). Diese Daten deuten darauf hin, dass ein Anstieg der PT im frühen Erwachsenenalter eine altersabhängige proteostatische Dysfunktion auslöst und den Alterungsprozess vor allem über aggregationsanfällige LLTPs vorantreibt.

Sofern nicht anders angegeben, sind alle Behandlungen auf das frühe Erwachsenenalter (Tag 0–10) beschränkt. a ApoLp-Überexpression im frühen Erwachsenenalter hebt CHX-vermittelte proteostatische Verbesserungen am Tag 50 auf. b ApoLp-Überexpression im frühen Erwachsenenalter hebt CHX-vermittelte Langlebigkeit weitgehend auf (weiblich: + 10,9 % vs. + 45,5 %, männlich: + 8,2 % vs. + 44,3 % , p < 0,0001). Die Überexpression von ApoLp im frühen Erwachsenenalter allein verkürzt die Lebensdauer (p <0, 0001), aber der Effekt ist geringer als der, den wir bei gleichzeitiger CHX beobachten (proportionale Gefahrenanalyse in ergänzender Abbildung 7). c Die Überexpression von Vg-1 im frühen Erwachsenenalter hebt die CHX-vermittelten proteostatischen Verbesserungen am Tag 50 weitgehend auf. d Die Überexpression von Vg-1 im frühen Erwachsenenalter hebt die CHX-vermittelte Langlebigkeit weitgehend auf (weiblich: + 9,6 % vs. + 28,8 %, männlich: + 7,4 % vs. + 27,9 %, p < 0,0001). Allein die Überexpression von Vg-1 im frühen Erwachsenenalter verkürzt die Lebensspanne (p <0,0001), der Effekt ist jedoch geringer als der, den wir bei gleichzeitiger CHX beobachten (proportionale Gefahrenanalyse in der ergänzenden Abbildung 7). e Met (Methopren, 25 µg/ml) im frühen Erwachsenenalter hebt CHX-vermittelte proteostatische Verbesserungen am Tag 50 auf; jedoch stellt der gleichzeitige ApoLp-Knockdown im frühen Erwachsenenalter die CHX-vermittelten proteostatischen Verbesserungen am Tag 50 wieder her. f Frühes Erwachsenenalter Met hebt die CHX-vermittelte Langlebigkeit weitgehend auf (p < 0,0001); Allerdings stellt der gleichzeitige Abbau von ApoLp im frühen Erwachsenenalter die Lebenserwartung weitgehend wieder her (p < 0,0001). g Met im frühen Erwachsenenalter hebt CHX-vermittelte proteostatische Verbesserungen am Tag 50 auf; jedoch stellt der gleichzeitige Abbau von Vg-1 im frühen Erwachsenenalter die CHX-vermittelten proteostatischen Verbesserungen am Tag 50 wieder her. h Met im frühen Erwachsenenalter hebt die CHX-vermittelte Langlebigkeit weitgehend auf (p < 0,0001); Allerdings stellt der gleichzeitige Abbau von Vg-1 im frühen Erwachsenenalter die Lebenserwartung weitgehend wieder her (p < 0,0001). Immunoblots: n = 3/Gruppe; Zweifaktorielle ANOVA mit Sidak-Korrektur. Lebensdauerexperimente: n = 250/Gruppe (jedes Geschlecht); Log-Rank-Test. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um zu untersuchen, ob LLTPs nachgelagerte Ziele von JH bei der Vermittlung altersabhängiger proteostatischer Dysfunktion/Alterung sind, haben wir LLTPs ausgeschaltet, während wir Fliegen im frühen Erwachsenenalter mit CHX und Met behandelten (ergänzende Abbildung 7f). Wie bereits gezeigt, brachte CHX nach Met-Behandlungen im frühen Erwachsenenalter keine Vorteile mehr für die Proteostase im Alter; Der gleichzeitige Abbau von ApoLp im frühen Erwachsenenalter ermöglichte jedoch wieder eine verbesserte Proteostase bei Fliegen im Alter und verhinderte altersbedingte Ansammlungen von IUP (Abb. 5e). Auch wenn Met im frühen Erwachsenenalter die Langlebigkeitsvorteile, die durch die Blockierung der PT-Erhöhung im frühen Leben erzielt wurden, weitgehend aufhob, stellte der gleichzeitige ApoLp-Knockdown im frühen Erwachsenenalter die Effekte der Verlängerung der Lebensspanne fast vollständig wieder her (Abb. 5f). Wir beobachteten ähnliche Ergebnisse nach Vg-Knockdown im frühen Erwachsenenalter (Abb. 5g, h). Diese Ergebnisse legen nahe, dass JH während des PT-Anstiegs im frühen Erwachsenenalter die Proteostase im Alter beeinträchtigt und sich hauptsächlich über LLTPs negativ auf die zukünftige Lebensspanne auswirkt.

Die Fettkörperreifung im frühen Erwachsenenalter erfordert JH und ist für die LLTP-Produktion verantwortlich32,33. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass die Eliminierung des PT-Anstiegs im frühen Leben Vorteile für die Langlebigkeit bringen könnte, indem sie hauptsächlich den Umbau des Fettkörpers hemmt. Um diese Hypothese zu testen, unterdrückten wir PT nur im Fettkörper, indem wir S6KKQ unter dem fettkörperspezifischen Treiber (S106-GS) überexprimierten. Dies führte zu einer Reduzierung der PT im Fettkörper um ~ 90 %, ohne dass andere Gewebe beeinträchtigt wurden (ergänzende Abbildung 8a). Allerdings führte die CHX-Behandlung im frühen Erwachsenenalter bei beiden Geschlechtern immer noch zu einer signifikanten Verlängerung der Lebensspanne (ergänzende Abbildung 8b). Wir haben dies weiter getestet, indem wir den Fettkörper abgetragen haben, indem wir Reaper (Apoptose-Induktor) unter dem Fettkörper-Treiber überexprimiert haben. Auch nach der Ablation des Fettkörpers verbesserte CHX im frühen Erwachsenenalter die Lebenserwartung in ähnlichem Maße deutlich (ergänzende Abbildung 8c, d). Wir wiederholten diese Experimente mit einem anderen fettkörperspezifischen Treiber (S32-GS) und erzielten ähnliche Ergebnisse (ergänzende Abbildung 8e, f). CHX im frühen Erwachsenenalter hatte auch keinen signifikanten Einfluss auf die Ölrot-O-Färbung und den Triglyceridspiegel im Körperfett (ergänzende Abbildung 8g). Ebenso konnte die Induktion der PT-Erhöhung im frühen Erwachsenenalter bei Chico-Homozygoten die Fettspeicherung im Körper nicht stimulieren, obwohl dies ausreichte, um ihre Langlebigkeitsvorteile zunichte zu machen (ergänzende Abbildung 8h). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Vorteile der Blockierung der PT-Erhöhung im frühen Erwachsenenalter nicht vollständig durch den Umbau des Fettkörpers allein erklärt werden können; Andere Gewebe als der Fettkörper sind bei der Erhöhung des PT im frühen Leben betroffen, was sich auf die Alterungsverläufe im späteren Leben auswirkt. Bemerkenswert ist, dass Körperfett nicht die einzige Hauptquelle für LLTPs ist; LLTPs werden auch überwiegend in Keimbahnstammzellen (GSCs), Neuronen, Glia, Herzmuskeln, Nephrozyten usw. synthetisiert.38.

Wir haben auch gezeigt, dass CHX im frühen Erwachsenenalter die Lebensdauer nicht dadurch verlängert, dass es einfach die Fortpflanzungsfunktionen von Fettkörperproteinen beeinträchtigt. Obwohl die Überexpression von LLTPs im frühen Erwachsenenalter die CHX-vermittelte Langlebigkeit weitgehend aufhob, stellte sie die beeinträchtigte Eiproduktion im frühen Erwachsenenalter nicht wieder her (ergänzende Abbildung 8i, j). Dies deutet darauf hin, dass die aggregationsfördernden Eigenschaften von Fettkörperproteinen und nicht ihre Fortpflanzungsfunktionen für die Regulierung der Lebensspanne von entscheidender Bedeutung sein könnten.

Da der Umbau des Fettkörpers allein nicht ausreichte, um die durch die Unterdrückung der frühen PT-Erhöhung erzielten Langlebigkeitsvorteile vollständig zu erklären, untersuchten wir alternative Mechanismen. Die GSC-Proliferation erreicht im frühen Erwachsenenalter ihren Höhepunkt, um die Fortpflanzungsfähigkeit im frühen Leben zu verbessern39. Wir stellten die Hypothese auf, dass sich die Erhöhung der PT im frühen Erwachsenenalter auf die GSCs auswirken würde, da sie tiefgreifende Auswirkungen auf die frühe Eiproduktion hatte. Interessanterweise verursachen proliferative GSCs bei C. elegans einen starken Abfall der zellulären Stressreaktionen (CSR) zu Beginn der Fortpflanzungsreife im frühen Erwachsenenalter, indem sie Hsp70 und Hsp1640 epigenetisch zum Schweigen bringen. Tatsächlich verhindert die Hemmung der GSC-Proliferation oder die Ablation von GSCs den steilen Rückgang der CSR im frühen Erwachsenenalter, verbessert die Proteostase im Alter und verbessert die Lebensdauer40,41,42,43. Wir untersuchten daher, ob die Erhöhung der PT im frühen Erwachsenenalter eine GSC-abhängige Stummschaltung der CSR auslöst.

In Übereinstimmung mit früheren C. elegans-Studien40 nahm die Hitze-/oxidative Stressresistenz bei Drosophila innerhalb von 4 Tagen nach dem frühen Erwachsenenalter stark ab, was durch GSC-Ablation vollständig verhindert werden konnte42 (ergänzende Abbildung 9a, b). Bemerkenswert ist, dass wie bei der GSC-Ablation durch die Eliminierung der frühen Erhöhung der PT mit CHX der starke Abfall der Stressresistenz im frühen Erwachsenenalter vollständig verhindert wurde (Abb. 6a, b). Um zu untersuchen, ob die Erhöhung der PT im frühen Leben die Stressresistenz transkriptionell verändert, führten wir RNAseq-Analysen an Fliegen +/– oxidativem Stress (Paraquat [PQ]) +/– CHX-Behandlung im frühen Erwachsenenalter durch. Wir beobachteten, dass sich das Transkriptionsprofil als Reaktion auf PQ vom Tag 0 bis zum Tag 10 dramatisch veränderte; Nach der CHX-Behandlung im frühen Erwachsenenalter ähnelte das Transkriptionsprofil der Fliegen des 10. Tages jedoch dem der Fliegen des 0. Tages (Abb. 6c). Tag 0 fliegt als Reaktion auf PQ hochregulierte CSR-Gene, die für die Resistenz gegen oxidativen/Hitzestress, die Entgiftung und den xenobiotischen Stoffwechsel wichtig sind, während Gene herunterreguliert werden, die für die Fortpflanzung, den Eisenstoffwechsel und die Bildung der extrazellulären Matrix wichtig sind (Abb. 6c, ergänzende Abb. 10a, b). ). Tag 10 fliegt jedoch als Reaktion auf PQ hochregulierte Gene, die für die Reproduktion und die Bildung der extrazellulären Matrix wichtig sind, während CSR-Gene herunterreguliert werden (Abb. 6c, ergänzende Abb. 11a, b). Nach der Blockierung der Erhöhung der PT im frühen Leben mit CHX regulierten Fliegen am Tag 10, ähnlich wie Fliegen am Tag 0, die CSR-Gene hoch, während sie Gene herunterregulierten, die für die Fortpflanzung, den Eisenstoffwechsel und die Bildung der extrazellulären Matrix wichtig sind (Abb. 6c, ergänzende Abb. 12a, b). ). Die CHX-Behandlung im frühen Erwachsenenalter führte auch zu einer Hochregulierung von Genen, die für die Proteinfaltung und den Mikrotubuli-Umbau wichtig sind, während sie gleichzeitig Gene herunterregulierte, die für Apoptose, antibakterielle Reaktionen, Phospholipid-Metabolismus usw. wichtig sind.

Die Behandlung mit CHX (1 µM) im frühen Erwachsenenalter verhindert den starken Abfall von (a), der Widerstandsfähigkeit gegen oxidativen Stress (p < 0,0001) und b, der Widerstandsfähigkeit gegen Hitzestress (p < 0,0001) im frühen Erwachsenenalter. Oxidativer Stress: 10 mM Paraquat; Hitzebelastung: 38 °C. Jedes Geschlecht: n = 250/Gruppe; Log-Rank-Test. (c), (Links) Heatmap der differentiellen Genexpression durch RNAseq nach 10 mM Paraquat in Fliegen am Tag 0 und Fliegen am Tag 10, die mit Vehikel oder CHX behandelt wurden. n = 8/Gruppe. FC=Fachwechsel. (Rechts) Die drei wichtigsten biologischen GO-Prozesse, angereichert mit Genen, die nach Paraquat in mit Vehikel oder CHX behandelten Fliegen am 10. Tag hoch-/herunterreguliert werden. Weiße Zahlen in Balkendiagrammen geben die Faltungsanreicherung an. CHX im frühen Erwachsenenalter verstärkt (d) die Sod-1-Induktionen als Reaktion auf 10 mM Paraquat und (e) die Hsp-22/Hsp-23-Induktionen als Reaktion auf 38 °C bei intakten Keimbahnstammzellen (GSC)-Fliegen, jedoch nicht in GSC-ablatierten Fliegen. Steuerung 1 = w1118 > UAS-bam; Kontrolle 2 = NGT-GAL4 > w1118; GSC abgetragen=NGT-GAL4 > UAS-bam. n = 12/Gruppe; Zweifaktorielle ANOVA mit Sidak-Post-hoc-Test. f Verlängerung der Lebensspanne im frühen Erwachsenenalter (Tag 0–10) CHX wird durch GSC-Ablation verringert (weiblich: +10,6 % vs. + 46,7 %, männlich: + 12,1 % vs. + 30,8 %). Jedes Geschlecht: n = 250/Gruppe; Log-Rank-Test. g CHX im frühen Erwachsenenalter verbessert die Lebensdauer sowohl bei fruchtbaren Kontrollen als auch bei sterilen OvoD1-Mutanten. WT-Wildtypen. n = 250/Gruppe; Log-Rank-Test. h Vorgeschlagenes Modell, das Mechanismen beschreibt, durch die ein erhöhter PT im frühen Erwachsenenalter eine proteostatische Dysfunktion auslöst und das Altern vorantreibt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

In Übereinstimmung mit unseren RNAseq-Daten wurde die Induktion der Gene sod-1, hsp-22 und hsp-23 unter oxidativem/Hitzestress im frühen Erwachsenenalter deutlich abgeschwächt; Sowohl die GSC-Ablation als auch die Blockierung des frühen Anstiegs der PT stellten jedoch die Induktion dieser CSR-Gene vollständig wieder her (Abb. 6d, e, ergänzende Abb. 9c, d). Eine CHX-Behandlung im frühen Lebensalter scheint die Stressresistenz zu verbessern, indem sie die GSC-abhängige Stummschaltung von CSR-Genen hemmt. Dies wird dadurch unterstützt, dass die Blockierung der Erhöhung der PT im frühen Leben die Stressresistenz und die Induktion von CSR-Genen bei GSC-intakten Fliegen erhöhte, jedoch nicht bei GSC-ablatierten Fliegen (ergänzende Abbildungen 9a, b, Abbildungen 6d, e). Darüber hinaus reduzierte die Blockierung der Erhöhung der PT im frühen Leben die GSC-Proliferation im frühen Erwachsenenalter erheblich (ergänzende Abbildung 9e).

Anschließend untersuchten wir, ob der frühe Anstieg der PT das Altern über GSC-Signale reguliert. Bei GSC-intakten Fliegen verbesserte die Blockierung der Erhöhung der PT im frühen Leben die Lebensdauer deutlich (Abb. 6f; Weibchen: + 41,5 %, Männchen: + 42,5 %). Bei GSC-ablatierten Fliegen brachte die CHX-Behandlung im frühen Leben immer noch einen Langlebigkeitsvorteil, aber das Ausmaß dieses Vorteils ist wesentlich geringer als der bei GSC-intakten Fliegen (Abb. 6f; weiblich: + 7,9 %, männlich: + 9,7 %). ). Die Unterdrückung des frühen Anstiegs der PT verbesserte die Lebensspanne nicht einfach durch die Herbeiführung von Sterilität und die Abschaffung der Überlebenskosten für die Produktion von Gameten. Wir haben gezeigt, dass die CHX-Behandlung im frühen Erwachsenenalter die Lebensspanne in GSC-intakten dominanten weiblich-sterilen Mutantenlinien (OvoD1)44 verlängerte, ähnlich wie bei fruchtbaren Hintergründen (Abb. 6g). Unsere Daten deuten darauf hin, dass der Anstieg der PT im frühen Erwachsenenalter die transkriptionelle Stummschaltung von CSR-Genen auslöst und altersbedingte Rückgänge hauptsächlich über GSC-Signale vorantreibt.

Zusammenfassend lässt unsere Arbeit vermuten, dass die vorübergehende Erhöhung der PT im frühen Erwachsenenalter das Proteostase-Netzwerk im späteren Leben umgestaltet und zukünftige Alterungsverläufe über zwei Signalwege verändert (Abb. 6h). Wir zeigen, dass die Erhöhung der PT im frühen Erwachsenenalter die JH-Signalübertragung verstärkt, wodurch LLTPs, einschließlich Vitellogenine und Apolipophorine, hochreguliert werden. Diese zur Aggregation neigenden LLTPs unterstützen die Fortpflanzung, lösen jedoch im Alter eine proteostatische Dysfunktion aus. Parallel dazu steigert die Erhöhung der PT im frühen Leben die GSC-Proliferation, wodurch CSR-Gene transkriptionell zum Schweigen gebracht werden, die möglicherweise für die Aufrechterhaltung der Proteostase unerlässlich sein können. Wir schlagen vor, dass diese beiden Wege zusammen zu altersbedingten Funktionseinbußen führen können.

Wir zeigen, dass der vorübergehende Anstieg des PT im frühen Erwachsenenalter langanhaltende negative Auswirkungen auf den Alterungsverlauf hat, indem er im Alter eine proteostatische Dysfunktion auslöst. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die schnelle Unterdrückung von PT nach dem frühen Erwachsenenalter entscheidend für die Linderung der proteostatischen Belastung im späten Leben, die Verlangsamung des altersbedingten Funktionsverlusts und die Verbesserung der Lebens-/Gesundheitsspanne sein kann. Unsere Studien deuten darauf hin, dass der Anstieg und Abfall des PT im Laufe der Zeit die Alterung in die entgegengesetzte Richtung beeinflussen könnte, als bisher angenommen wurde.

Wir schlagen vor, dass die frühe Erhöhung der PT einen antagonistischen pleiotropen Effekt darstellt, der bei jungen Erwachsenen positive Auswirkungen hat, im Alter jedoch letztendlich schädliche Auswirkungen hat und die Seneszenz vorantreibt. Ein hoher PT im frühen Leben kann die Fortpflanzung fördern, indem er die GSC-Proliferation stimuliert und den LLTP-Spiegel über JH erhöht. Die GSC-Proliferation ist für die kontinuierliche Produktion von Gameten unerlässlich, und LLTPs sind wichtig für die Reifung von Spermien/Eiern45,46,47. Im späten Erwachsenenalter können jedoch zur Aggregation neigende LLTPs eine proteostatische Dysfunktion auslösen. Darüber hinaus können sich vermehrende GSCs durch die Stummschaltung von CSR-Genen, die zum Altern beitragen können, die Anfälligkeit für proteostatischen Stress erhöhen. Obwohl wir LLTPs und JH als Schlüsselmoleküle identifiziert haben, die während der Erhöhung des PT im frühen Leben synthetisiert werden und altersbedingte Verschlechterungen beschleunigen können, waren diese Faktoren allein nicht für alle Auswirkungen auf die Langlebigkeit verantwortlich.

Wir haben gezeigt, dass im frühen Erwachsenenalter synthetisierte LLTPs eine altersabhängige proteostatische Dysfunktion auslösen; Der genaue zugrunde liegende molekulare Mechanismus muss jedoch noch geklärt werden. LLTPs mit stark angereicherten β-Faltblattstrukturen können als Keime fungieren, um eine Fehlfaltung/Aggregation anderer nativer Proteine ​​auszulösen oder bereits fehlgefaltete Proteine ​​einzufangen48. Alternativ können LLTPs Lipide (Energiequellen) in die Keimbahn abgeben, auf Kosten der Herabregulierung der Wartung/Reparatur in somatischen Geweben. Tatsächlich sind LLTPs für den Transport von Lipiden aus somatischen Geweben, hauptsächlich dem Darm, zur Keimbahn und zur Unterstützung der Fortpflanzung unerlässlich49. Interessanterweise erschöpfen sich die Lipidspeicher im Darm nach der GSC-Ablation mit zunehmendem Alter nicht mehr und durch den Abbau von überschüssigem Fett werden einfach ungesättigte Fettsäuren erzeugt, die als bioaktive Lipidsignale zur Verbesserung der Proteostase/Lebensdauer dienen50,51,52. Zukünftige Lipidomstudien werden dabei helfen, festzustellen, ob im frühen Erwachsenenalter synthetisierte LLTPs die Lipidverteilung/-zusammensetzung verändern, um die Proteostase in somatischen Geweben umzugestalten.

Eine Erhöhung der PT im frühen Erwachsenenalter kann eine Ursache für den altersbedingten Rückgang bei anderen Tierarten als Drosophila sein. Beispielsweise behalten langlebige mutierte Insulin/IGF-1-Rezeptor-Daf-2-Würmer, ähnlich wie homozygote Chico-Fliegen, im Gegensatz zu Wildtypen2 einen niedrigen PT im frühen Erwachsenenalter bei. Darüber hinaus führte eine vorübergehende Behandlung langlebiger Ames-Zwergmäuse mit Wachstumshormon (GH) im frühen postnatalen Leben zu einem weitgehenden Verlust ihrer Langlebigkeit53,54. Da GH ein wichtiger endokriner Faktor ist, der PT stimuliert und im frühen Erwachsenenalter bei Säugetieren (einschließlich Menschen) stark ansteigt55, kann GH die Lebenserwartung von Säugetieren regulieren, indem es den Anstieg des PT im frühen Erwachsenenalter moduliert. LLTPs, die im frühen Erwachsenenalter synthetisiert werden, können auch den altersbedingten Rückgang bei Tieren höherer Ordnung regulieren. Hundertjährige zeigten niedrige LLTP-Werte, die mit einem verringerten Risiko für altersbedingte Stoffwechsel-/Herz-Kreislauf-Erkrankungen in Verbindung gebracht wurden und einst als Langlebigkeitssyndrom vorgeschlagen wurden56,57,58. Weitere Studien sind erforderlich, um festzustellen, ob die Regulierung der Langlebigkeit durch die frühe PT-Erhöhung bei anderen Tierarten erhalten bleibt.

Unsere Arbeit legt nahe, dass der altersbedingte Rückgang der PT wahrscheinlich kein passives Nebenprodukt des Alterns ist, sondern eine adaptive Reaktion, die die lebenslange Reproduktionsleistung maximiert und altersbedingte funktionelle Rückgänge verlangsamt. Die PT beginnt bereits am zweiten Tag nach dem Schlüpfen zu sinken und erreicht am 15. Tag ein niedriges Grundniveau. Fliegen vermehren sich in diesem Alter immer noch aktiv mit der höchsten Eiproduktion am ca. 10. Tag. Als wir den altersbedingten Rückgang der PT blockierten, fliegen die Fliegen zeigten in früheren Jahren eine verkürzte Lebensdauer und eine Verschlechterung der Fortbewegung, der kognitiven Funktionen und der Integrität der Darmbarriere. Sie erlebten auch eine beschleunigte reproduktive Alterung mit einem Rückgang der gesamten Eiproduktion um etwa 50 %. Da ein altersbedingter Rückgang der PT vor dem Fruchtbarkeitsgipfel auftritt und positive Auswirkungen auf das Fortpflanzungsergebnis haben kann, nehmen wir an, dass Tiere einer aktiven Selektion unterliegen, um die Proteintranslation zu unterdrücken, um funktionelle Rückgänge zu verzögern und ihre Fortpflanzungsperiode zu verlängern.

Unsere Ergebnisse stützen die Ansicht, dass langfristige Gesundheits- und Alterungsverläufe durch vorübergehende biologische Veränderungen, die früh im Leben auftreten, moduliert werden können. Diese Studie bietet einen theoretischen Rahmen zum Verständnis, wie der Anstieg und Abfall der PT die Alterungsverläufe bestimmt. Unsere Arbeit liefert auch eine Grundlage für zukünftige Forschungen, einschließlich der Frage, ob ein hoher PT im frühen Erwachsenenalter ein potenzielles frühes biologisches Ereignis/einen Marker für altersbedingte Krankheiten ist.

chico1/chico1 wurde von Dr. Marc Tatar bereitgestellt; w1118 und Daughterless-GeneSwitch-GAL4 (daGS) wurden von Dr. Scott Pletcher bereitgestellt; Tubulin-GeneSwitch-GAL4 (tubGS) wurde von Dr. David Walker bereitgestellt; UAS-apoLp wurde von Dr. Joaquim Culi bereitgestellt; UAS-bam wurde von Dr. Erika Bach bereitgestellt; UAS-Stretchin-Mlck wurde von Dr. Mark VanBerkum bereitgestellt. Die restlichen Fliegenschnüre wurden vom Bloomington Drosophila Stock Center und FlyORF bezogen. Die Linien ovoD1 und UAS/GAL4 wurden 8–10 Mal mit w1118 rückgekreuzt. Die Transgenexpression wurde durch qRT-PCR bestätigt. Alle Fliegenschnüre wurden in einem befeuchteten Inkubator mit 25 °C und 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklen gehalten. Fliegen wurden auf Agar-Maismehl-Dextrose-Hefe-Wachstumsmedium (CT)59 entwickelt und nach dem Ausschlüpfen auf 10 % Zucker/Hefe (SY10)-Medium übertragen60. Man ließ die Fliegen 48 Stunden lang paaren, trennte/sortierte sie in Weibchen und Männchen und hielt sie von da an als getrennte Geschlechter in SY10-Fläschchen (25 Fliegen/Fläschchen). Für Lebensdauertests wurden 10 Fläschchen/Gruppe für jedes Geschlecht verwendet. Alle 2–3 Tage wurden die Fliegen ohne Begasung in frisches SY10-Medium überführt und das Überleben bewertet. Die dLife-Software61 wurde verwendet, um das Überleben aufzuzeichnen und die mittlere/maximale Lebensdauer mittels Logrank-Analyse zu analysieren. Die Fläschchen wurden hinsichtlich der Position auf dem Tablett randomisiert und halbblind gemacht, um die Auswirkungen von Umwelt-/Untersuchervoreingenommenheit zu reduzieren.

Vor den Stressherausforderungen wurden die Fliegen 4 oder 10 Tage lang mit 1 µM Cyclohexamid (CHX; ChemService)/Wasser (Vehikel), gelöst in SY10, vorbehandelt. Für Tests zur Widerstandsfähigkeit gegen oxidativen Stress62 wurden Fliegen in Fläschchen überführt, die ein halbes Kimwipe enthielten, das in 1 ml 5 % Saccharose und 10 mM Paraquat (Sigma) getränkt war. Die Fliegen wurden alle 8 Stunden in frische Fläschchen mit Paraquat/Saccharose-Medium überführt, tote Fliegen wurden nach jedem Transfer bewertet. Für Tests zur Hitzestressresistenz63 wurden Fliegen Hitze (38 °C) ausgesetzt, indem sie Fläschchen in einem Wasserbad versenkten. Die Mortalität wurde in 30-Minuten-Intervallen aufgezeichnet. Für beide Stressresistenztests wurden 10 Fläschchen (jeweils 25 Fliegen)/Gruppe für jedes Geschlecht verwendet. Für die qRT-PCR von Stressresistenzgenen und RNAseq wurden Fliegen 12 Stunden lang mit Paraquat behandelt oder 1 Stunde lang 38 °C ausgesetzt (n = 12/Gruppe für jedes Geschlecht).

Wie zuvor18 wurden Fliegen (über eine Luftpumpe) abwechselnd zwei neutralen Gerüchen (3-Octanol [OCT] und 4-Methylcyclohexanol [MCT], 1/10 Verdünnung in Mineralöl) ausgesetzt. Das Training umfasste 3 Trainingsrunden mit abwechselnden Gerüchen, 5 Minuten pro Runde und die Exposition gegenüber einem 100-V-60-Hz-Schock mit einem der Gerüche. Alle Behandlungen wurden unter schwachem Rotlicht durchgeführt. Der mit dem Elektroschock verbundene Geruch wechselte zwischen den Fläschchen. Nach dem Training wurde den Fliegen eine Stunde Zeit gegeben, sich zu erholen, und sie wurden dann in ein T-Labyrinth (Celexplorer-Labors) gelegt. Gegensätzliche Gerüche wurden von gegenüberliegenden Seiten des Labyrinths gepumpt. Den Fliegen wurde 2 Minuten Zeit gegeben, das Labyrinth zu erkunden. Anschließend wurden die Labyrinthabschnitte versiegelt und die Anzahl der Fliegen in jeder Kammer wurde bewertet. Vor dem Training wurde die natürliche Geruchspräferenz bestimmt, indem Fliegen zwei Minuten lang zwei Gerüchen ausgesetzt wurden. Anschließend wurden die Fliegen in ihren jeweiligen T-Labyrinth-Armen gefangen, betäubt und gezählt. Die Ergebnisse wurden mittels Chi-Quadrat-Analyse ausgewertet. Für jede Gruppe wurden N = 50 Fliegen x 4 Fläschchen/Alter verwendet.

Als Kontrollmaßnahmen wurden in einer separaten Kohorte sensomotorische Reaktionen auf die Gerüche und den Stromschlag ermittelt64. Geruchsvermeidungsreaktionen wurden quantifiziert, indem naive Fliegen einem der beiden Gerüche (OCT oder MCT) im Vergleich zur Luft im T-Labyrinth ausgesetzt wurden. Die Fähigkeit, Elektroschocks zu spüren und ihnen zu entkommen (Schockreaktivität), wurde bei naiven Fliegen quantifiziert, indem elektrifizierbare Gitter in beide Arme des T-Labyrinths eingefügt wurden, aber nur in einem Arm des T-Labyrinths Schockimpulse abgegeben wurden und den Fliegen die Wahl zwischen den beiden Armen ermöglicht wurde zwei Arme. Nach 2 Minuten wurden die Kammertüren geschlossen und die Anzahl der Fliegen in jedem Arm gezählt. Für jede Gruppe wurden N = 50 Fliegen x 4 Fläschchen verwendet.

Wie zuvor19 wurden die Fliegen bis zum Tag des Schlumpftests auf normalem SY10-Medium gealtert. Gefärbtes SY10-Medium wurde durch Zugabe von Blue Dye #1 (FD&C) in einer Konzentration von 2,5 % (Gew./Vol.) hergestellt. Die Fliegen wurden 9 Stunden lang auf gefärbtem Medium gehalten. Fliegen wurden als Schlumpf eingestuft, wenn eine Färbung außerhalb des Verdauungstrakts beobachtet werden konnte. Für jedes Geschlecht wurden N = 25 Fliegen x 10 Fläschchen/Gruppe verwendet.

Die spontane Aktivität wurde mit einem Drosophila-Aktivitätsmonitor (Trikenetic) bewertet. Die Aktivität wurde in einem befeuchteten Inkubator bei 25 °C mit 12-stündigen Hell-/Dunkel-Zyklen aufgezeichnet. Vor der Datenerfassung durften sich die Fliegen 8 Stunden lang akklimatisieren. Gesamtaktivität pro 12-Stunden-Zyklus quantifiziert und durch die Anzahl der Fliegen dividiert. Für jedes Geschlecht, n = 10 Fläschchen (20 Fliegen pro Fläschchen).

Die Fütterung wurde anhand der Aufnahme/Ausscheidung von farbstoffhaltigem Futter gemessen65. SY10-Medien mit 1 % w/v Blue Dye #1 (FD&C) wurden in Kunststoffkappen abgefüllt, die in breite Kunststofffläschchen passen. Nach 24-stündiger Inkubation bei 25 °C wurden Futterkappen und Fliegen entfernt. Fliegen wurden in 1,5 ml Wasser homogenisiert, um verbrauchten Farbstoff aufzufangen. Anschließend wurden die Proben zentrifugiert, um Pelletreste zu entfernen. Der von Fliegen an den Wänden der Fläschchen ausgeschiedene Farbstoff (ausgeschiedener Fläschchenfarbstoff, ExVial) wurde durch Zugabe von 3 ml Wasser zu den Fläschchen und anschließendes Vortexen gesammelt. Die Absorption der INT- und ExVial-Farbstoffe in Wasserextrakten wurde bei 630 nm in einem Plattenlesegerät (SpectraMax iD3) bestimmt. Die Absorption wurde durch Interpolation aus einer Standardkurve in verbrauchte Medienvolumina umgerechnet. Zur Kontrolle der Hintergrundabsorption wurden Extrakte von Fliegen verwendet, denen Medien ohne Farbstoffe verabreicht wurden. Für jedes Geschlecht wurden N = 15 Fliegen x 10 Fläschchen/Gruppe verwendet. Zur Messung des Körpergewichts wurden 10 Fliegen 10 Tage lang mit ± 1 µM CHX (ChemService)/± 200 µM RU486 (Cayman Chemical) behandelt, mit vorgewogenen 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen gesammelt und mit einer Präzisionsmikrowaage gewogen. Für jedes Geschlecht wurden 10 Röhrchen/Gruppe verwendet.

10 Weibchen und 10 Männchen wurden zwei Tage lang nach den Schlüpfen gepaart. Anschließend wurden die Weibchen getrennt und als getrennte Geschlechter in SY10-Fläschchen gehalten (n = 20 Fläschchen/Gruppe; 5 Weibchen/Fläschchen). Die Fruchtbarkeit wurde als Anzahl der Eier bestimmt, die pro Weibchen in jedem Fläschchen nach 24 Stunden im angegebenen Alter über die gesamte Lebensspanne gelegt wurden, gezählt unter einem Stereomikroskop.

Die BrdU-Färbung erfolgte wie zuvor in Lit. beschrieben. 66. Eierstöcke von Fliegen, die mit 1 µM CHX/Vehikel behandelt wurden (Tag 0–5), wurden in abwechselnder Reihenfolge in Grace-Medium (Lonza) seziert und auseinandergezogen und in demselben Medium mit BrdU (1 mg/ml, Sigma) bei inkubiert 1 Stunde bei 25 °C. Nach 3 Wäschen mit PBT (10 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 175 mM NaCl, pH 7,4, 0,1 % Triton X-100) wurden die Eierstöcke mit 4 % Paraformaldehyd für 10–15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Nach einstündiger Blockierung mit 5 % normalem Ziegenserum in PBT wurden primäre und sekundäre Antikörper hinzugefügt. Die verwendeten Antikörper waren: Mäuse-Anti-BrdU (G3G4, DSHB, 1:50), Ratten-Anti-Vasa (ein Geschenk von Dr. Paul Lasko; 1:50), Alexa Fluor 488-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus und Alexa Fluor 568- konjugierte Ziege-Anti-Ratte-Sekundärantikörper (Thermo Scientific, 1:300). Die Proben wurden in Vectashield mit DAPI (Vector Laboratory) montiert und mit dem konfokalen Mikroskop Carl Zeiss LSM 700 abgebildet. Für die Co-Lokalisierungsanalyse wurde das JACoP-Plugin von ImageJ verwendet. Nach Anpassung des Schwellenwerts in verschiedenen Kanälen wurde der prozentuale Bereich der Co-Lokalisierung ermittelt.

Wie zuvor67 wurden die Fliegen in 500 µL PBST (0,05 % (v/v) Tween 20 in PBS) mit einem Kunststoff-Pistill-Motormischer homogenisiert. 200 µL Lysat wurden 5 Minuten lang bei 70 °C inkubiert, auf Eis gekühlt und mit 1 µL 25 KU/ml Lipoproteinlipase aus Chromobacterium viscosum (Calbiochem) über Nacht bei 37 °C inkubiert. Trümmer wurden durch 3-minütige Zentrifugation bei 14.000 U/min entfernt. Der Triglyceridgehalt wurde bestimmt, indem 15 µL des Überstands mit 150 µL Free Glycerol Reagent (Sigma) gemischt, 6 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und die Absorption bei 540 nm gemessen wurde. Der Triglyceridgehalt wurde auf den Gesamtproteingehalt normalisiert, der mit dem Bradford-Assay bei 595 nm gemessen wurde. Um den Triglyceridspiegel im Fettkörper zu messen, wurden Fliegen in kaltem PBST präpariert und die gesammelten Fettkörper wurden mit den gleichen Verfahren wie oben beschrieben verarbeitet. Zur Bestimmung des Glykogenspiegels wurden 30 µL des Überstands (nach der Behandlung mit Lipoproteinlipase) 1 Stunde lang bei 50 °C mit 14 Einheiten Amyloglucosidase (Sigma) behandelt. 15 µL der behandelten Mischung wurden mit 150 µL Glucose-Reagens (Sigma) kombiniert, 30 Minuten bei 37 °C inkubiert und die Absorption bei 340 nm gemessen. Der Glykogengehalt wurde ebenfalls auf das Gesamtprotein normalisiert. Es wurden Dreifachversuche mit jeweils 10 Fliegen pro Altersgruppe verwendet.

Wie zuvor68,69 wurden intakte Fettkörper/Kadaver in PBS zerlegt und 20 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert, dann dreimal mit PBS gewaschen und 20 Minuten lang in frischer Oil Red O-Lösung (6 ml 0,1 % Oil Red) inkubiert O in Isopropanol und 4 ml destilliertem Wasser gelöst und durch eine 0,45-µM-Spritze geleitet), gefolgt von Spülen mit destilliertem Wasser. Die Proben wurden in Vectashield mit DAPI (Vector Laboratory) montiert und durch Lichtmikroskopie abgebildet. Die Färbung wurde durch Image J quantifiziert.

Wie zuvor70 wurden auf normalem SY10-Medium gealterte Fliegen 24 Stunden lang auf dem SY10-Medium, ergänzt mit 2,5 µCi 35S-Methionin (American Radiolabeled Chemicals)/ml Futter, platziert und inkubiert. 15 Fliegen wurden eingefroren und dann in 500 µL 1 % SDS gemahlen und 5 Minuten lang gekocht. Anschließend wurden die Proben 5 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert und der Überstand isoliert. Das Protein wurde mit 5 % TCA ausgefällt und 1 Stunde auf Eis gehalten. Die Proben wurden 5 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert und das Pellet zweimal mit eiskaltem 95 %igem Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde in 100 µL 1 % SDS resuspendiert und der Proteingehalt wurde mit dem BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, IL) gemessen. Die 35S-Radioaktivität wurde mittels Flüssigkeitsszintillation (Beckman, Fullerton, CA) gemessen. Der 35S-Einbau wurde durch Normalisierung der 35S-Zählungen/Minute auf den Gesamtproteinspiegel berechnet.

Wie zuvor17 wurden auf normalem SY10-Medium gealterte Fliegen 24 Stunden lang auf dem SY10-Medium, ergänzt mit 600 µM Puromycin (Fisher Bioreagents), platziert und inkubiert. 15 Fliegen wurden eingefroren und in 160 µL RIPA-Puffer, ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitoren, bei 4 °C gemahlen. Das Homogenat wurde 15 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert und der Überstand isoliert. Der Lysatproteingehalt wurde mithilfe des BCA-Protein-Assays (Pierce, Rockford, IL) bestimmt. Die Proben wurden mit Laemmli-Probenpuffer, ergänzt mit 5 % β-Mercaptoethanol, gemischt und vor dem Immunoblot 5 Minuten lang bei 95 °C gekocht. Normalisierte Proben wurden auf SDS-10 %-PAGE-Gelen laufen gelassen, gefolgt von Standard-Western-Blot-Verfahren. Die Gesamtproteinbeladung wurde mittels Ponceau S (Sigma)-Färbung sichtbar gemacht. Es wurden Anti-Maus-Puromycin-Antikörper [3RH11] (Kerafast, 1:1000) und polyklonaler Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper (IRDye 800CW, LI-COR, 1:5000) verwendet. Bildgebung und Quantifizierung wurden mit dem Odyssey-System (LI-COR) und Image J durchgeführt. Die Proteintranslationsraten wurden durch Normalisierung des Puromycin-Einbaus auf Ponceau-Färbung bestimmt.

Wie zuvor durchgeführt17, wurden ganze Fliegenkörper mit einem Plastikstößel in 10 mM HEPES (pH 7,4), 5 mM DTT und 1x komplettem Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche) homogenisiert und 15 Minuten lang bei 4 °C und 14.000 g zentrifugiert. 0,15 U/µl Mikrokokken-Nuklease (New England BioLabs) und 1 mM CaCl2 wurden zum Überstand gegeben und 4 Minuten lang bei 20 °C inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 2 mM EGTA. Translationsreaktionsmischungen enthielten 40 % (v/v) Extrakt, 2 nM Luciferase-RNA, 100 µM Aminosäuremischung (Promega), 50 mM Kaliumacetat, 2,5 mM Magnesiumacetat, 0,1 mM Spermidin, 20 U RNase-Inhibitor (Fisher), 20 mM Kreatinphosphat (Roche Applied Science) und 80 ng/µl Kreatinkinase (Roche Applied Science). Die Mischung wurde bei 26 °C in einer SpectraMax iD3-Platte inkubiert, wobei die Lumineszenz alle 5 Minuten gemessen wurde. Die Steigung des linearen Teils der Luciferase-Aktivitätskurve wurde zur Berechnung der Rate der In-vitro-Proteintranslation verwendet.

Ganze Körper von 2 Fliegen (n = 12/Gruppe) wurden mit einem Plastikstößel in 100 μl gekühltem Proteasompuffer (50 mM Tris, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7,4) homogenisiert. Anschließend wurden die Proben verwirbelt und 15 Minuten lang bei 21.000 g und 4 °C zentrifugiert. In einer schwarzen 96-Well-Platte wurden 10 μl Überstand zu 80 μl Proteasompuffer hinzugefügt, ergänzt mit zusätzlichen 5 mM ATP, um die 26 S-Proteasomaktivität zu messen. Abschließend wurden jeder Vertiefung 50 μM fluoreszierendes Suc-LLVY-AMC-Substrat in 10 μL Proteasompuffer zugesetzt, um die Chymotrypsin-ähnliche Aktivität zu messen. Die Platte wurde 4 Stunden lang bei 37 °C in einem SpectraMax iD3-Plattenlesegerät inkubiert, wobei alle 10 Minuten die Fluoreszenz mit 355-nm-Anregung gemessen und bei 460-nm-Emission gemessen wurde. Die gesamte Proteasomaktivität pro Probe wurde als Delta zwischen Anfangs- und Endmessungen definiert.

RNA wurde aus Fliegen unter Verwendung einer Standard-Trizol-Methode mit 2 ganzen Tieren oder 20 Köpfen (n = 12/Gruppe) isoliert. Mit NanoDrop quantifizierte RNA. Die cDNA wurde unter Verwendung des High-Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit (Applied Biosystems) in technischen Dreifachansätzen gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Es wurde SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Expression der Zielgene wurde gemessen und auf Rp49 normalisiert. Die verwendeten Primer waren Rp49: 5'-CGCTTCAAGGGACAGTATCTG-3' und 5'-AAACGCGGTTCTGCATGA-3'; Sod-1: 5'-GGACCGCACTTCAATCCGTA-3' und 5'-TGGAGTCGGTGATGTTGACC-3'; GstD-1: 5'-CGCGCCATCCAGGTGTATTT-3' und 5'-CTGGTACAGCGTTCCCATGT-3'; GstE-1: 5'-ATAATGGCACTTTCATCTGGGAC-3' und 5'-CACTGGCATCGAAGAAGAGAC-3'; Katalase: 5'-GATGCGGCTTCCAATCAGTTG-3' und 5'-GCAGCAGGATAGGTCCTCG-3'; TrxR-1: 5'-TGGAGTCGGTGATGTTGACC-3' und 5'-GAAGGTCTGGGCGGTGATTG-3'; Hsp-22: 5'- GCCTCTCCTCGCCCTTTCAC-3' und 5'-TCCTCGGTAGCGCCACACTC-3'; Hsp-23: 5'-GGTGCCCTTCTATGAGCCCTACTAC-3' und 5'-CCATCCTTTCCGATTTTCGACAC-3'; Hsp-68: 5'-GAAGGCACTCAAGGACGCTAAAATG-3' und 5'-CTGAACCTTGGGAATACGAGTG-3'; Hsp-70: 5'-AGCCGTGCCAGGTTTG-3' und 5'-CGTTCGCCCTCATACA-3'; Stretchin-Mlck: 5'-TCACTGGCGGAGAACTGTTC-3' und 5'-CGGGTGCTTTCGTATCCAGT-3'; Pdh: 5'-ATAGCCAAGACCTTCGGTAACA-3' und 5'-GCACTCAGTGTGGAATTGATGAT-3'; apoLp: 5'-TTGGAATCCTAGCTTCTGTGCT-3' und 5'-AGTCATAGTAGTTGCCGGGTAT-3'; Vit-1: 5'-CAACTCCGTCAACCAGGCATT-3' und 5'-GACAGGTGGTAGACTTGCTGC-3'; Vit-2: 5'-GCACCCTTTGCGTTATGGC-3' und 5'-TAGAGCTTGTCCAACAGCGTA-3'

Wie zuvor17 wurden 15 Fliegen/Altersgruppe frisch zubereitet und in 200 µL Puffer A (20 mM Tris-HCl [pH 8,0], 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 1X Protease und Phosphatase) homogenisiert Inhibitor-Cocktails [Fisher Scientific]). Die Lysate wurden verwirbelt und 15 Minuten lang bei 4 °C und 21.000 g zentrifugiert. Die Überstände repräsentierten die waschmittellösliche Proteinfraktion. Die Pellets wurden in 500 µL Puffer A gewaschen, gevortext und 15 Minuten bei 4 °C und 21.000 g zentrifugiert. Die Pellets wurden in 100 µL Puffer B (10 mM Tris-HCl [pH 7,5], 2 % SDS, 1X Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktails) resuspendiert, 1 Minute lang beschallt (6 x 10 s-Impulse) und bei Raumtemperatur inkubiert 15 Minuten. Die Extrakte wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 500 g geklärt, wodurch in Detergens unlösliche Fraktionen erhalten wurden. Die Gesamtproteinkonzentration in den extrahierten Fraktionen wurde mithilfe des BCA-Protein-Assays (Pierce, Rockford, IL) bestimmt, und normalisierte Proben wurden auf SDS-10 %-PAGE-Gelen laufen gelassen, gefolgt von einem Standard-Western-Blot-Verfahren. Die verwendeten Antikörper waren: Kaninchen-Anti-Ubiquitin-Antikörper (Cell Signaling, 1:1000), Kaninchen-Anti-β-Actin-Antikörper (Cell Signaling, 1:1000) und polyklonaler Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (IRDye 680RD, LI-COR, 1:5000). Bildgebung und Quantifizierung wurden mit dem Odyssey-System (LI-COR) und ImageJ durchgeführt und die Aggregatwerte wurden als durch Aktinspiegel normalisierte Ubiquitinsignale berechnet.

Der Gesamtgehalt an Juvenilhormon wurde für ganze Körper von Fliegen des Tages 0 und des Tages 2 quantifiziert, die 2 Tage nach der Eklosion mit ± 1 µM CHX behandelt wurden. Für jede Gruppe wurden 25 Proben gesammelt, die jeweils aus 75 Fliegen bestanden, die in 1,5 ml 90 %igem Methanol in HPLC-Qualität homogenisiert wurden. Proben werden bis zur Analyse bei −80 °C gelagert. JH wurde mit zunehmend polareren Hexanlösungen extrahiert, säulengereinigt und in ein d3-Methoxyhydrin-Derivat umgewandelt. Die Gesamt-JH wurde mit einer etablierten GC-MS-Methode71,72 gemessen, durchgeführt auf einem Agilent 8890 Series GC, ausgestattet mit einer 30 m x 0,25 mm ZB-Wax GC-Säule (Phenomenex) und einem gekoppelten Agilent 7000D Triple-Quadrupol-Massenspektrometer. Die Probenpeaks wurden analysiert und auf m/z 76 und 225 überwacht, um die Spezifität für JHIII sicherzustellen. Die Gesamthäufigkeit von JHIII wurde anhand einer Standardkurve berechnet und auf die Nassmassen normiert.

In Reinigungsmitteln lösliche/unlösliche Proteinextrakte wurden wie oben beschrieben isoliert. Für jedes Alter wurde n = 8/Gruppe (jeweils abgeleitet aus ganzen Körpern von 15 weiblichen Fliegen) verwendet. Die Proteomikanalyse wurde wie zuvor beschrieben73 mit geringfügigen Änderungen in Abschnitt 2.5 nLC-ESI-MS2 unter Protein-IDs für GeLC durchgeführt. Alle Proteinextrakte wurden mit dem Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert und eine festgelegte Proteinmenge pro Probe wurde mit NuPAGE LDS-Probenpuffer (Invitrogen) auf 35 µL verdünnt. Anschließend wurden die Proteine ​​mit DTT reduziert und 10 Minuten lang bei 70 °C denaturiert, bevor alles auf Novex NuPAGE 10 % Bis-Tris-Proteingele (Invitrogen) geladen und getrennt wurde (35 Minuten bei konstant 200 V). Die Gele wurden über Nacht mit Novex Colloidal Blue (Invitrogen) gefärbt. Nach der Entfärbung wurde jede Spur in mehrere MW-Fraktionen (3–8 Fraktionen) geschnitten und in 100 mM Ammoniumbicarbonat (AmBc) äquilibriert. Jeder Gelpfropfen wurde dann über Nacht mit Trypsin Gold, Massenspektrometriequalität (Promega), gemäß den Anweisungen des Herstellers verdaut. Peptidextrakte wurden in 0,1 % Ameisensäure (FA)/ddH2O bei 0,1 µg/µL rekonstituiert.

Peptidverdaus (jeweils 8 µl) wurden auf einen 1260 Infinity nHPLC-Stack (Agilent Technologies) injiziert und unter Verwendung einer C-18-Säule mit 75 Mikron ID x 15 cm gezogener Spitze (Jupiter C-18 300 Å, 5 Mikron, Phenomenex) aufgetrennt. Dieses System läuft in Reihe mit einem Hybrid-Massenspektrometer Thermo Orbitrap Velos Pro, das mit einer Nanospray FlexTM-Ionenquelle (Thermo Fisher Scientific) ausgestattet ist, und alle Daten wurden im CID-Modus erfasst. Die nHPLC ist mit binären mobilen Phasen konfiguriert, die Lösungsmittel A (0,1 % FA in ddH2O) und Lösungsmittel B (0,1 % FA in 15 % ddH2O/85 % ACN) enthalten und wie folgt programmiert sind: 10 Min. bei 5 % B (2 µL/Min., Beladung), 90 Min. bei 5–40 % B (linear: 0,5 nL/Min., Analyse), 5 Min. bei 70 % B (2 µL/Min., Waschen), 10 min @ 0 % B (2 µL/min, äquilibrieren). Nach dem Elternionenscan (300–1200 m/z bei 60 k Auflösung) wurden Fragmentierungsdaten (MS2) für die 15 intensivsten Ionen gesammelt. Für datenabhängige Scans wurden die Ladezustandsüberprüfung und der dynamische Ausschluss mit einer Wiederholungszahl von 2, einer Wiederholungsdauer von 30 s und einer Ausschlussdauer von 90 s aktiviert.

XCalibur RAW-Dateien wurden im Profilmodus gesammelt, zentriert und mit ReAdW v. 3.5.1 in MzXML konvertiert. Anschließend wurden mgf-Dateien mit MzXML2Search (in TPP v. 3.5 enthalten) für alle Scans erstellt. Die Daten wurden dann mit SEQUEST (Thermo Fisher Scientific) durchsucht, das auf drei maximale Fehlspaltungen, ein Vorläufermassenfenster von 20 ppm, Trypsinverdau, variable Modifikation C @ 57,0293 und M @ 15,9949 als Basiseinstellung mit zusätzlichen PTMs eingestellt ist (z. B. Phos, Ox, GlcNAc usw.), die zu einem späteren Zeitpunkt angewendet werden können, wenn experimentell festgestellt wurde, dass sie von Bedeutung sind. Die Suche wurde mit einer artspezifischen Teilmenge der UniProtKB-Datenbank durchgeführt.

Die Liste der Peptid-IDs, die auf der Grundlage der SEQUEST-Suchergebnisse generiert wurden, wurde mit Scaffold (Protein Sciences, Portland, Oregon) gefiltert. Scaffold filtert und gruppiert alle Peptide, um nur hochzuverlässige IDs und normalisierte Spektralzahlen (N-SCs) über alle Proben hinweg zum Zweck der relativen Quantifizierung zu generieren und beizubehalten. Die Filtergrenzwerte wurden mit einer minimalen Peptidlänge von > 5 AAs, ohne MH + 1-Ladungszustände, mit Peptidwahrscheinlichkeiten von > 80 % CI und mit einer Anzahl von Peptiden pro Protein ≥ 2 festgelegt. Die Proteinwahrscheinlichkeiten wurden festgelegt auf ein > 99,0 %-KI und einen FDR < 1,0. Scaffold umfasst die beiden gängigsten Methoden zur statistischen Validierung großer Proteomdatensätze, die False Discovery Rate (FDR) und die Proteinwahrscheinlichkeit74,75,76. Die relative Quantifizierung über die Experimente hinweg wurde dann mittels Spektralzählung77,78 durchgeführt, und wenn relevant, wurden die Häufigkeiten der Spektralzählungen zwischen den Proben normalisiert79.

Genontologie-Zuordnungen und Signalweganalysen wurden mit MetaCore (GeneGO Inc., St. Joseph, MI) durchgeführt. In MetaCore identifizierte Interaktionen werden mithilfe von Volltextartikeln manuell korreliert. Detaillierte Algorithmen wurden zuvor in Lit. beschrieben. 80,81. Für die generierten Proteomdaten wurden zwischen jedem paarweisen Vergleich zwei separate nichtparametrische statistische Analysen durchgeführt. Diese nichtparametrischen Analysen umfassen 1) die Berechnung von Gewichtswerten durch Signifikanzanalyse von Microarray (SAM; Grenzwert >|0,8| kombiniert mit 2) T-Test (zweiseitig, ungleiche Varianz, Grenzwert von p < 0,05), die dann bei jedem Vergleich nach der höchsten statistischen Relevanz sortiert werden. Für SAM82,83, wobei der Gewichtungswert (W) eine statistisch abgeleitete Funktion ist, die sich der Signifikanz nähert, wenn der Abstand zwischen den Mittelwerten (μ1-μ2) für jede Gruppe zunimmt und die SD (δ1-δ2) abnimmt, unter Verwendung der Formel W = (μ1-μ2)/(δ1-δ2). Für mit N-SCs bestimmte Proteinhäufigkeitsverhältnisse legen wir eine 1,5- bis 2,0-fache Änderung als Schwelle für die Signifikanz fest, die wir empirisch durch Analyse der inneren Quartildaten aus den Kontrollexperimenten mithilfe von ln-ln-Diagrammen ermitteln, wobei der Pierson-Korrelationskoeffizient (R ) beträgt 0,98 und > 99 % der normalisierten Intensitäten fielen zwischen der eingestellten Faltungsänderung. In jedem Fall müssen alle drei Tests (SAM, T-Test oder Fold Change) bestanden werden, um als signifikant zu gelten.

Zur Durchführung statistischer Analysen wurden das Softwarepaket Prism (Graphpad Software 8) und das Softwarepaket Microsoft Office 2016 Excel verwendet. Für alle statistischen Analysen wurde ein zweiseitiger p < 0,05 als statistisch signifikant akzeptiert. Alle Analysen wurden für mehrere Vergleiche angepasst. Detaillierte Informationen zu statistischen Tests, p-Werten und n/N-Zahlen finden Sie in den jeweiligen Abbildungen, Abbildungslegenden und Methoden.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Proteomdaten wurden in der PRIDE-Datenbank unter dem Zugangscode PXD044118, https://doi.org/10.6019/PXD044118, hinterlegt. Die in dieser Studie generierten RNAseq-Daten wurden in der Gene Expression Omnibus-Datenbank unter dem Zugangscode GSE239506 hinterlegt. Alle weiteren Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und in den Zusatzinformationsdateien sowie auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Marc Tatar, Scott Pletcher, David Walker, Erika Bach, Joaquim Culi, Mark VanBerkum, Bloomington Drosophila Stock Center und FlyORF für Fliegenbestände. Wir danken Paul Lasko für die Bereitstellung von Antikörpern. Diese Forschung wurde unterstützt durch NIA/NIH R56-AG061051 & RF1 AG065301 (AP), Glenn Foundation for Medical Research, (AP), American Federation for Aging Research (AFAR) Grants for Junior Faculty (AP), Voelcker Young Investigator Award (AP). ), San Antonio Nathan Shock Center (AP), San Antonio Pepper Center (AP), Barshop Institute T32 Program on the Biology of Aging NIA T32-AG021890 (HK, EM), UAB Medical Scientist Training Program NIH T32-GM008361 (HK) und South Texas Medical Scientist Training Program NIH T32-GM113896 (HK). Die Fliegenbilder wurden unter der Creative Commons-Lizenz „Characteristics and traits: Figure 10“ von OpenStax College, Biology, CC BY 4.0 verwendet: https://openstax.org/books/biology/pages/12-2-characteristics-and -Züge.

Zentrum für Neurodegeneration und experimentelle Therapeutika, Abteilung für Neurologie, University of Alabama in Birmingham, Birmingham, AL, 35294, USA

Harper S. Kim, Danitra J. Parker, Madison M. Hardiman und Andrew M. Pickering

Ausbildungsprogramm für medizinische Wissenschaftler, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, 35294, USA

Harper S. Kim

Barshop Institute for Longevity and Aging Studies, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, TX, 78229, USA

Harper S. Kim, Erin Munkacsy, Nisi Jiang, Yidong Bai und Andrew M. Pickering

Ausbildungsprogramm für medizinische Wissenschaftler, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, TX, 78229, USA

Harper S. Kim

Abteilung für Integrative Biologie und Pharmakologie, McGovern Medical School an der UTHealth, Houston, TX, 77030, USA

Danitra J. Parker und Andrew M. Pickering

MDI Biological Laboratory, Bar Harbor, ME, 04672, USA

Aric N. Rogers

Abteilung für Zellsysteme und Anatomie, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, TX, 78229, USA

Yidong Bai

USDA-ARS Arid Land Agricultural Research Center, Maricopa, AZ, 85138, USA

Colin Brent

Abteilung für Anästhesiologie und perioperative Medizin, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, 35249, USA

James A. Mobley

Fachbereich Biologie, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, 35294, USA

Steven N. Austad

Nathan Shock Center, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, 35294, USA

Steven N. Austad

Abteilung für Molekulare Medizin, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, TX, 78229, USA

Andrew M. Pickering

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HK führte die meisten Experimente mit Hilfe von DP, MH, EM, NJ, YB und AR durch; JM führte LC/ESI-MS/MS durch und analysierte Proteomikdaten; CB führte GC/MS durch, um den Juvenilhormonspiegel zu messen. HK, SA und AP konzipierten die Forschung, analysierten die Daten und verfassten das Manuskript. Alle Autoren haben eine endgültige Fassung dieses Manuskripts gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Andrew M. Pickering.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kim, HS, Parker, DJ, Hardiman, MM et al. Ein Anstieg der Proteintranslation im frühen Erwachsenenalter treibt das Altern über Juvenilhormon-/Keimbahnsignale voran. Nat Commun 14, 5021 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40618-x

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Eingegangen: 17. März 2023

Angenommen: 01. August 2023

Veröffentlicht: 18. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40618-x

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