Transplantation von FVIII/ET3

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4206 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Hämophilie A ist die häufigste X-chromosomale Blutungsstörung, von der weltweit mehr als eine halbe Million Menschen betroffen sind. Bei Personen mit schwerer Hämophilie A liegt der FVIII-Gerinnungsspiegel unter 1 % und es kommt zu spontanen, schwächenden und lebensbedrohlichen Blutungen. Fortschritte bei Hämophilie-A-Therapeutika haben die Gesundheitsergebnisse deutlich verbessert, aber die Entwicklung von FVIII-inhibitorischen Antikörpern und Durchbruchblutungen während der Therapie erhöhen die Morbidität und Mortalität der Patienten erheblich. Hier verwenden wir Schafföten im menschlichen Äquivalent von 16–18 Schwangerschaftswochen und wir zeigen, dass die pränatale Transplantation menschlicher Plazentazellen (107–108/kg), die biotechnologisch hergestellt wurden, um ein optimiertes FVIII-Protein zu produzieren, zu einem erheblichen Anstieg der FVIII-Plasmaspiegel führt Bleibt >3 Jahre nach der Behandlung bestehen. Zellen implantieren sich in wichtige Organe, und keiner der Empfänger reagiert immun gegen die Zellen oder den von ihnen produzierten FVIII. Somit belegen diese Studien die Machbarkeit, den immunologischen Vorteil und die Sicherheit der Behandlung von Hämophilie A vor der Geburt.

Hämophilie A (HA), die häufigste X-chromosomale Blutungsstörung, tritt bei 24,6 pro 100.000 männlichen Lebendgeburten auf und betrifft weltweit über eine halbe Million Menschen1. Personen mit schwerer HA (PHA) weisen weniger als 1 % des normalen Plasmaspiegels der FVIII-Aktivität auf und erleiden lebensbedrohliche spontane Blutungen, einschließlich Bindegewebs-/Muskelhämatomen, inneren Blutungen und Hämarthrosen, die zu chronisch schwächenden Arthropathien führen2. Trotz der jüngsten Fortschritte bei den aktuellen Therapien, die den Behandlungsstandard erheblich verbessert haben3, ist die Krankheitslast bei PHA weiterhin hoch, da sich bei Gelenkerkrankungen innerhalb der ersten 50 Expositionstage bei 25–40 % der Patienten hemmende Antikörper entwickeln zu FVIII und die Prävention von Durchbruch- und/oder lebensbedrohlichen Blutungen stellt weiterhin eine Herausforderung dar4,5.

Eine aktuelle Studie hat gezeigt, dass die Chancen auf ein Leben von normaler Dauer und Qualität für Menschen, die mit Hämophilie geboren wurden, in Ländern mit hohem Einkommen um 33 % und in Ländern mit niedrigem Einkommen um 93 % sinken1. Diese ernüchternden Statistiken zeigen, dass es immer noch dringende ungedeckte klinische Bedürfnisse gibt, die die Entwicklung neuartiger Therapieansätze erfordern, um das Überleben und die Lebensqualität dieser Patienten zu erhöhen.

Die Behandlung genetischer Störungen während der pränatalen Phase mittels In-utero-Transplantation (IUTx) wird seit Jahrzehnten bei Menschen im Rahmen von Compassionate Use sicher durchgeführt6. Kürzlich wurden klinische Studien zur Rekrutierung von Probanden eingeleitet, um die Sicherheit und Durchführbarkeit der Verwendung von IUTx zur Behandlung von Feten mit α-Thalassämie (NCT02986698), Osteogenesis imperfecta (NCT03706482) oder lysosomalen Speicherkrankheiten (NCT04532047) festzustellen. Diese Studien belegen den dringend notwendigen Perspektivwechsel bei der Behandlung von Patienten mit monogenen Störungen und haben die Sicherheit dieser Art von Verfahren sowohl für schwangere Frauen als auch für die betroffene Person weiter nachgewiesen7.

Ungefähr 70 % der Menschen mit HA haben eine familiäre Vorgeschichte der Krankheit, was eine pränatale Diagnose und Intervention ermöglicht. Die Entwicklung pränataler Therapien, die in der Lage sind, FVIII-Spiegel bereitzustellen, die heilend sind oder ausreichen, um eine schwere, lebensbedrohliche Blutgerinnungsstörung in einen milden Phänotyp umzuwandeln, während sie gleichzeitig eine Immuntoleranz gegenüber dem FVIII-Produkt induzieren und dadurch das Risiko der Bildung von FVIII-Inhibitoren beseitigen , hätte erhebliche positive Auswirkungen auf die Lebenserwartung und Lebensqualität von HA-Patienten und würde den Versorgungsstandard in der HA-Behandlung verändern8,9.

Während sich die Gentherapie im Uterus in präklinischen Studien als vielversprechend erwiesen hat10, ermöglicht die Transduktion von Zellen in vitro Sicherheitsmaßnahmen in der Produktion, die mit der direkten Vektorinjektion nicht möglich sind, und eliminiert das Risiko einer unbeabsichtigten Transduktion unerwünschter Gewebe/Zellen, z. B. der Keimbahn. Darüber hinaus ist IUTx unter Verwendung von Zellen, die sich in vivo physiologisch vermehren und klinisch therapeutische FVIII-Spiegel absondern, ein vielversprechender und sicherer Ansatz zur Bereitstellung einer langfristigen/dauerhaften Korrektur von HA6. Wir haben kürzlich berichtet, dass menschliche Plazentazellen (PLC) eine hervorragende Zellplattform für die Produktion und Sekretion von FVIII in vivo darstellen, wenn sie mit einem Lentivektor transduziert werden, der für ein myeloisches Codon optimiertes, biotechnologisch hergestelltes FVIII (PLC-mcoET3) kodiert11. Hier zeigen wir anhand von Wildtyp-Schafen als Großtiermodell für IUTx, dass die Verabreichung von PLC-mcoET3 im Äquivalent von 16–18 Schwangerschaftswochen (GW) beim Menschen zu erhöhten FVIII-Plasmaspiegeln führte, die über denen der Kontrollgruppe lagen -IUTx-Tiere um >48,4 ± 12,3 %, für > 3 Jahre nach der Geburt, trotz der schnellen und erheblichen Gewichtszunahme, ohne Anzeichen einer therapiebedingten Toxizität, noch der Entwicklung von Anti-FVIII/ET3-IgGs, FVIII-Inhibitoren oder ET3-spezifische Th1- oder Th2-Zellen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass mit IUTx behandelte Empfänger keine Immunität oder Anti-HLA-Antikörper gegen das transplantierte menschliche PLC entwickelten, aber eine robuste Reaktivität gegenüber fremden Antigenen beibehielten. Die RNA- und DNA-Analyse bewies die Transplantation und fortgesetzte Expression des vektorkodierten mcoET3 in allen wichtigen Organen. Diese Therapie führte auch dazu, dass bei einem HA-Schaf trotz der schwierigen Geburt keine Blutung auftrat. Diese Studien belegen somit die Machbarkeit, den immunologischen Vorteil und die Sicherheit der Behandlung von HA während der pränatalen Phase.

Insgesamt 25 Tiere wurden in utero (IUTx) mit menschlichen, aus der Plazenta stammenden mesenchymalen Zellen (PLC) transplantiert, die mit einem lentiviralen Vektor transduziert wurden, der für mcoET3 kodiert, ein myeloisches Codon-optimiertes, biotechnologisch hergestelltes FVIII-Transgen12 (PLC-mcoET3), im Alter von 59–65 Jahren Gestationstage (gd), was ~16–18 GW beim Menschen entspricht, bei geschätzten Dosen von 107–108 Zellen/kg, wie im Studiendesign und in der Ergänzungstabelle 1 detailliert beschrieben. Die in dieser Studie verwendete PLC-mcoET3-Masterzellbank war zuvor beschrieben in Bezug auf Isolierung, Kultur, phänotypische Charakterisierung, vor und nach der Transduktion11. Die Tiere wurden ein (n = 13) bis drei (n = 8) Jahre nach IUTx beobachtet. Die Auswertung der Plasma-FVIII-Aktivität in bestimmten Abständen während der Dauer der Studie, ausgedrückt als prozentualer Anstieg gegenüber der nicht transplantierten Kontrollgruppe, zeigte, dass die behandelten Tiere im ersten Jahr einen Gesamtanstieg von 54,3 ± 7,5 % (n = 13) im Plasma aufwiesen FVIII-Aktivität (Abb. 1a); Bemerkenswert ist, dass für eine normale Blutstillung mindestens 25 % der Faktor-VIII-Aktivität erforderlich sind. Wichtig ist, dass die erhöhte FVIII-Aktivität trotz des exponentiellen Wachstums der Tiere aufrechterhalten wurde, die zum Zeitpunkt der Transplantation etwa 0,1 kg, bei der Geburt 3,7 ± 0,34 kg und im Alter von 1 Jahr 62 ± 4,1 kg wogen (Abb. 1b). Von 12 bis 24 Monaten nach der Geburt lag der mittlere Anstieg der FVIII-Aktivität weiterhin bei 47,4 ± 16,8 % (n = 10) und schwankte bei acht von neun Tieren zwischen 14 % und 191 %, wobei eines den Wert von 5 nicht erreichte % FVIII-Anstieg (Abb. 1c). Die Auswertung von acht Tieren im dritten Jahr nach IUTx ergab einen durchschnittlichen Anstieg der FVIII-Aktivität von insgesamt 48,4 ± 12,3 %, wobei zwei Tiere eine FVIII-Aktivität zwischen 5 und 20 % aufwiesen (Abb. 1d). Um festzustellen, ob der Prozentsatz an FVIII mit der Zeit nach der Transplantation signifikant abnahm, wurde eine Analyse durchgeführt, bei der die Unterschiede zwischen den mittleren Werten der erhöhten FVIII-Aktivität im ersten und dritten Jahr nach der Transplantation ausgewertet wurden. Die Ergebnisse sind in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Alle bis auf eine Der Empfänger behielt trotz der stetigen Gewichtszunahme, die nach 36 Monaten 124 kg bzw. 95 kg für Männer und Frauen erreichte, das Niveau der FVIII-Aktivität bei (oder veränderte sich nicht signifikant) (Abb. 1b).

Eine Auswertung der FVIII-Spiegel durch FVIII-Aktivitätstests im ersten Jahr nach der Geburt zeigte, dass alle behandelten Tiere einen Anstieg der Plasma-FVIII-Aktivität aufwiesen, der für eine normale Blutstillung sorgen könnte (n = 13 Tiere; jedes Tier wurde bei n = 3 bis n getestet). = 6 verschiedene Zeitpunkte, angezeigt durch Punkte/Tier); b Die Gewichtskurve zeigte, dass der Anstieg der FVIII-Aktivität trotz des exponentiellen Wachstums der Tiere (n = 13 Tiere) aufrechterhalten wurde; c Jahr 2 nach der Geburt war der mittlere Anstieg der FVIII-Aktivität bei neun Tieren weiterhin erhöht und eines erreichte keinen FVIII-Anstieg von 5 % (n = 10 Tiere; jedes Tier wurde zu n = 2 bis n = 6 verschiedenen Zeitpunkten getestet, wie durch Punkte/Tier angegeben); d Jahr 3 nach der Geburt zeigten sechs von acht Tieren einen erheblichen Anstieg der FVIII-Aktivität, während die FVIII-Aktivität bei den anderen beiden zwischen 5 und 20 % lag (n = 8 Tiere; jedes Tier wurde bei n = 2 bis n getestet). = 6 verschiedene Zeitpunkte, angezeigt durch Punkte/Tier); e Bestätigung des Vorhandenseins von ET3-Protein im Plasma behandelter Tiere durch LC-MS, was zeigt, dass der durch FVIII-Aktivitätstests festgestellte Anstieg der FVIII-Aktivität auf das Vorhandensein von ET3-Protein im Blutkreislauf zurückzuführen ist. LC-MS wurde als gezielter Ansatz verwendet und die normalisierte exklusive Intensität spiegelt den zusammengefassten Intensitätswert der Peptide wider, die nur mit diesem Protein assoziiert sind, und liefert somit die relative Häufigkeit von ET3 in jedem Schaf. Fettgedruckte Balken zeigen den Mittelwert ± SEM. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um das Vorhandensein von ET3-Protein im Plasma behandelter Tiere zu bestätigen, wurde Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS) durchgeführt. Eine datenunabhängige Analyse wurde verwendet, um die relative Häufigkeit von ET3 im Plasma jedes Tieres zu ermitteln und zeigte, dass der Anstieg der FVIII-Aktivität mit dem Vorhandensein von ET3-Protein im Blutkreislauf übereinstimmte. Abbildung 1e zeigt die exklusive Intensität, die den zusammengefassten Intensitätswert der Peptide widerspiegelt, die nur mit diesem Protein assoziiert sind.

Wir haben zuvor gezeigt, dass die Verabreichung von ET3- ​​oder hFVIII-Protein an junge Wildtyp-Schafe ab Woche 2 nach der Infusion eine starke Immunantwort gegen ET3/FVIII-IgG induziert und zur Entwicklung hemmender Antikörper führt13. Um zu untersuchen, ob das von den transduzierten Zellen bereitgestellte zirkulierende ET3-Protein bei IUTx-Tieren Anti-ET3-Antikörper induzierte, wurden zu mehreren Zeitpunkten nach der Geburt ET3-spezifische IgM- und IgG-ELISAs im Plasma durchgeführt. Wie in Abb. 2a, b gezeigt, entwickelte im ersten Jahr nach der IUTx keines der behandelten Tiere Anti-ET3-IgM- oder IgG-Antikörper. Auch im zweiten Jahr (Abb. 2c) wiesen alle bis auf einen Empfänger weiterhin keine Anti-ET3-IgG-Antikörper auf. Das eine Tier (17010), das 18 Monate nach der Transplantation einen Anti-ET3-IgG-Antikörper mit niedrigem Titer (1:20) aufwies, wurde mit anschließenden Anti-ET3-IgG-Antikörpertests genau beobachtet, und die Daten zeigten, dass der Anti-ET3-IgG-Antikörper war entweder vorübergehend oder ein Testartefakt. Detaillierte Ergebnisse der Anti-ET3-IgG-Antikörpertests, die im Zeitraum von 4 bis 24 Monaten bei diesem Tier durchgeführt wurden, sind in Abb. 2d dargestellt.

Anti-ET3-spezifische ELISAs wurden an seriellen Plasmaverdünnungen von IUTx-Tieren zu mehreren Zeitpunkten nach der Geburt (3–8 und 18 Monate) durchgeführt, um zu untersuchen, ob zirkulierendes ET3-Protein a IgM (n = 13 Tiere) oder b IgG-Antikörper induziert IUTx-Tiere: Jedes Tier wurde mindestens zweimal getestet, zu (b) einem früheren Zeitpunkt (n = 13 Tiere) und zu einem späten Zeitpunkt (c) (n = 12 Tiere), und für jeden Zeitpunkt wurden ELISAs in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Positive Antikörpertiter wurden als die Verdünnung von Plasma mit einem Absorptionswert > 2 SD über der mittleren OD aus ELISAs definiert, die mit Kontrollschafplasma durchgeführt wurden (gepunktete Linie). Im ersten Jahr nach der IUTx entwickelte keines der behandelten Tiere Anti-ET3-IgM- oder IgG-Antikörper, aber im zweiten Jahr wurde bei einem Tier (17010) ein Anti-ET3-IgG-Antikörper mit niedrigem Titer (1:20) nachgewiesen. Dieses Tier wurde mit anschließenden Anti-ET3-IgG-Antikörpertests genau beobachtet, und die Daten zeigten, dass (d) der zu verschiedenen Zeitpunkten (n = 5) gemessene Anti-ET3-IgG-Antikörper entweder ein vorübergehender Nicht-Inhibitor-Antikörper war, da die FVIII-Werte bestehen blieben hoch oder ein Testartefakt, da nachfolgende Proben dieses Tieres kein Anti-ET3-IgG enthielten. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um festzustellen, ob behandelte Tiere ET3-spezifische Gedächtnis-T-Zellen entwickelt hatten, wurden IFN-γ- und IL-4-ELISpot-Assays durchgeführt, um das Vorhandensein, die Sekretionsintensität und die Häufigkeit reaktiver ET3-spezifischer Gedächtnis-T-Zellen zu bestimmen. Keiner der IUTx-Empfänger beherbergte ET3-spezifische Th1- oder Th2-Lymphozyten (Abb. 3a bzw. b), während ihre Lymphozyten die Fähigkeit beibehielten, zu reagieren und IFN-γ und IL-4 abzusondern, wenn sie mit Phytohämagglutinin-L (PHA-L) stimuliert wurden. Dies zeigte, dass ihre Lymphozyten funktionsfähig waren, aktiviert werden konnten und in der Lage waren, die getesteten Zytokine abzusondern.

a IFN-γ- und b IL-4-ELISpot-Assays wurden durchgeführt, um das Vorhandensein reaktiver ET3-spezifischer Gedächtnis-T-Zellen zu bestimmen. Die Tests wurden doppelt durchgeführt und mit Zellen durchgeführt, die von jedem Tier (n = 13 Tiere) zu mindestens zwei verschiedenen Zeitpunkten im Bereich von 5 bis 20 Monaten nach der Geburt gesammelt wurden. Eine positive Reaktion wurde durch einen Stimulationsindex >2 und >10 SFU/2 × 105 PBMC (gepunktete Linie) definiert. IUTx-Empfänger (n = 13 Tiere) hatten keine ET3-spezifischen Th1- oder Th2-Lymphozyten, während ihre Lymphozyten die Fähigkeit beibehielten, zu reagieren und IFN-γ und IL-4 abzusondern, wenn sie mit Phytohämagglutinin-L (PHA-L) stimuliert wurden; c Keines der Lymphozyten der IUTx-Tiere (n = 13 Tiere) proliferierte in Gegenwart von PLC-mcoET3 (T) des gleichen Spenders oder nicht-transduziertem PLC (NT) des gleichen Spenders, wenn sie mit Einweg-MLRs getestet wurden, aber beibehalten signifikante proliferative Reaktion auf menschliche PBMC von Drittanbietern. Für jedes Tier wurden MLR-Tests dreifach zu zwei verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Zur Bestimmung signifikanter Unterschiede wurde eine einfaktorielle ANOVA gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest verwendet. p ≤ 0,05 wurde als signifikant angesehen. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001; ****p ≤ 0,0001. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um zu testen, ob PLC-mcoET3 immunogen ist und fötale Empfänger für die verabreichte Therapie sensibilisieren kann, wurden Einweg-Mischlymphozytenreaktionen (MLR) durchgeführt, indem die mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) der Empfänger mit (1) PLC desselben Spenders gemeinsam kultiviert wurden -mcoET3; (2) nicht transduzierte PLC desselben Spenders; (3) xenogene (menschliche) PBMCs von Drittanbietern oder (4) individuelle Selbst-PBMCs zur Festlegung des Basisstimulationsindex. Bei keinem der IUTx-Empfänger kam es zu einer signifikanten Veränderung der PBMC-Proliferation, wenn er mit entweder transduziertem PLC oder nicht-transduziertem PLC kokultiviert wurde und im Vergleich zur Kokultur mit individuellen Selbst-PBMC (Abb. 3c). Um zu untersuchen, ob die PBMC des IUTx-Empfängers anergisch geworden waren, wurden die PBMC des IUTx-Empfängers mit menschlichen PBMC von Drittanbietern stimuliert und zeigten im Vergleich zur entsprechenden Kontrolle eine deutlich erhöhte Zellproliferation Antigene (Abb. 3c).

Um zu untersuchen, ob die Verabreichung von PLC-mcoET3 eine humorale Immunantwort hervorrief, die zur Bildung von HLA-IgG-Antikörpern der Klasse I und/oder Klasse II führte, wurde zunächst die Sequenzierung verwendet, um den in dieser Studie verwendeten PLC-HLA-Typ zu definieren: A*02,24; B*18,51; C*02,07; DRB1*04,16; DRB4*01; DRB5*02; DQB1*03(DQ7),05; DQA1*01,03; DPA1*01; DPB1*04. Als nächstes wurden Festphasen-Pooled-Bead-Assays unter Verwendung eines Luminex 200 Multiplex-Systems durchgeführt, das für den Nachweis von Antikörpern in Schafserum modifiziert wurde. Die Ergebnisse dieses Screenings zeigten, dass keiner der IUTx-Empfänger gegen die Spenderzellen sensibilisiert war und ihr Panel-reaktiver Antikörperstatus (PRA) als negativ angesehen wurde (Abb. 4a). Bemerkenswert ist, dass ein Tier (17021) auf HLA-B45 reagierte, aber da die transplantierten Zellen dieses HLA-Antigen nicht enthielten, wurde dies als unspezifischer Antikörper angesehen. Ein anderes Tier (18007) zeigte ebenfalls mehrere unspezifische xenogene HLA-Antikörper. Daher untersuchten wir auch, ob (Kontroll-)Tiere, denen nie menschliche Zellen transplantiert wurden, natürlich vorkommende xenogene Antikörper aufwiesen, die mit den menschlichen HLA-Bead-Targets kreuzreaktiv waren. Die Ergebnisse zeigten, dass alle Kontrollen xenogene Antikörper mit einem breiten Spektrum an MFIs aufwiesen (Abb. 4a). Die Beurteilung der Anti-HLA-II-Antikörper in den Seren transplantierter Tiere und nicht transplantierter Kontrolltiere ergab, dass keines der Tiere eine positive PRA aufwies oder zumindest eine positive PRA, die für die transplantierten Zellen spezifisch war (Abb. 4b).

Dargestellt sind rohe Ergebnisse der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) aus Festphasen-Pooled-Bead-Assays, modifiziert für den Nachweis von (a) HLA-I- und (b) HLA-II-Antikörpern in IUTx-Schafseren (n = 13 Tiere). Ebenfalls enthalten sind die Ergebnisse von Positivkontrollkügelchen und unbehandelten Kontrolltieren. Für jedes Tier entsprechen die Punkte dem MFI jeder Perle im Panel. Wenn die MFI-Werte in ≥2 Perlen negativ waren, wurde ihr Panel-reaktiver Antikörperstatus (PRA) als negativ angesehen. Bei keinem der transplantierten Tiere wurde ein positiver PRA festgestellt, der für die transplantierten Zellen spezifisch ist; c Alanin-Aminotransferase (ALT) und Aspartat-Aminotransferase (AST) (n = 13 Tiere); d Hämatokritwerte (n = 13 Tiere); und e WBC (n = 13 Tiere) wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Geburt analysiert, jeweils dargestellt durch einen Punkt. Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede (ns) zwischen IUTx-behandelten Tieren und einem Pool von Kontrolltieren gefunden (p ≤ 0,05). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Zur Bestimmung signifikanter Unterschiede zwischen jedem Tier und dem Kontrolltier wurden eine einfaktorielle ANOVA gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstests verwendet. Gepunktete Linien kennzeichnen den oberen Normalbereich von AST und ALT. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um zu beurteilen, ob durch IUTx hepatische oder hämatologische Veränderungen hervorgerufen wurden, wurden in Abständen nach der Geburt die Anzahl der weißen Blutkörperchen (WBC), die Hämatokritwerte und die Leberenzyme Aspartataminotransferase (AST) und Alaninaminotransferase (ALT) analysiert. Alle transplantierten Tiere behielten normale ALT- und AST-Werte bei (Abb. 4c) und wiesen Hämatokritwerte (Abb. 4d) und Leukozytenzahl (Abb. 4e) im normalen Bereich auf, die sich nicht signifikant von der nicht transplantierten Gruppe innerhalb der Herde unterschieden.

Um die Stellen und den relativen Prozentsatz der PLC-mcoET3-Transplantation in verschiedenen Organen pränatal behandelter Tiere (n = 4) zu bestimmen, wurden die Empfänger bei der Geburt eingeschläfert, was etwa 3 Monate nach der Transplantation entspricht. Von besonderer Bedeutung ist, dass bei einem dieser Tiere während der Trächtigkeit mithilfe von aus Fruchtwasserzellen isolierter DNA und mittels Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus (RFLP) PCR14 HA diagnostiziert wurde. Die Diagnose wurde auch bei der Geburt anhand von DNA aus Hautfibroblasten bestätigt. Das HA-Tier wurde infolge von Wehen- und Entbindungskomplikationen tot geboren, und trotz des traumatischen Geburtsvorgangs zeigte das Tier bei der Autopsie keine Anzeichen der ausgedehnten abnormalen Blutung, über die bei dieser Linie von HA-Tieren berichtet wurde14,15.

RT-qPCR wurde unter Verwendung mcoET3-spezifischer Primer auf RNA durchgeführt, die aus Leber, Lunge, Milz und Thymusdrüse dieses HA-Tiers und der anderen eingeschläferten IUTx-Empfänger isoliert wurde. Um eine Standardkurve für die Quantifizierung zu erstellen, wurde RT-qPCR an RNA durchgeführt, die aus verschiedenen Prozentsätzen von PLC-mcoET3, gemischt mit Schaf-Stromazellen, isoliert wurde. Die aus den verschiedenen Geweben erhaltenen Ergebnisse wurden dann unter Verwendung der Standardkurve in Prozentsätze extrapoliert. Der Prozentsatz der PLC-mcoET3-Transplantation in Organen behandelter Tiere ist in Abb. 5a dargestellt, was zeigt, dass in allen analysierten Organen Zellen transplantiert wurden. Die gleichen Gewebeproben, die von nicht behandelten Kontrolltieren entnommen wurden, zeigten keine Zielamplifikation. qPCR unter Verwendung humaner Alu-spezifischer Primer in DNA, die aus denselben Geweben extrahiert wurde, wurde durchgeführt, um das Gesamtvorkommen transduzierter und nicht-transduzierter menschlicher Zellen zu bestimmen. Zur Extrapolation der Menge an menschlicher genomischer DNA wurde eine Standardkurve verwendet, die aus aus Schafgewebe extrahierter DNA mit steigenden Mengen an menschlicher DNA (0, 0,25, 0,5, 1, 5 und 10 ng) bis zu insgesamt 100 ng DNA pro Probe erstellt wurde in jedem Tier und in jedem Organ vorhanden (ergänzende Abbildung 2). Alle untersuchten Tiere und Gewebe enthielten menschliche DNA. Während in Milz und Thymus ähnliche Mengen menschlicher DNA gefunden wurden, unterschieden sich die Mengen menschlicher DNA bei verschiedenen Tieren in Leber und Lunge (ergänzende Abbildung 2).

eine RT-qPCR (dreifach) (n = 4 Tiere, n = 4 Experimente) unter Verwendung von mcoET3-spezifischen Primern auf RNA, die aus verschiedenen Organen isoliert wurde. Die Tiere wiesen in allen analysierten Organen ähnliche Mengen an transplantiertem PLC-mcoET3 auf; 18.002 hatten statistisch signifikant höhere Werte in Leber, Lunge und Thymusdrüse als 18.008; b Leberquantifizierung menschlicher Ku80-positiver Zellen mittels Immunhistochemie bestätigt das Vorhandensein von Spender-PLC-Zellen in allen Tieren (mit geringerer Empfindlichkeit als bei RT-qPCR); c–f repräsentative Bilder der Ku80-Färbung in der Leber (n = 3 Tiere) (weiße Pfeile = positive Zellen); c nicht transplantiertes Tier kontrollieren; d–f IUTx-Tiere (n = 3 Tiere); g-Isotyp-Kontrolle und h Vorhandensein von ET3/FVIII-produzierenden Zellen zwischen den Hepatozyten und verflochten mit den Lebersinusoiden im IUTx-HA-Tier nach Anti-Human-FVIII-Färbung. Da HA-Tieren mit dieser Mutation das Faktor-VIII-Antigen in allen Geweben fehlt (kreuzreaktives Material negativ), resultiert das nachgewiesene Vorhandensein von ET3/FVIII aus der Produktion von ET3/FVIII durch die transplantierten Zellen. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Olympus Fluoview FV1000-Mikroskop mit Olympus UPlanFLN-40×/1,30-Ölobjektiv aufgenommen (Maßstabsbalken: c–e = 100 µm; f–h = 50 µm). Der Prozentsatz positiver Zellen für die verschiedenen Marker wurde nach Zählung von mindestens 1500 DAPI+-Kernen (n = 3 Experimente) berechnet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Zur Bestimmung signifikanter Unterschiede wurde eine einfaktorielle ANOVA gefolgt von einem Tukey-Mehrfachvergleichstest verwendet (p ≤ 0,05 wurde als signifikant angesehen). Leber *p = 0,0406; Lunge *p = 0,0182 (18002-18008) und *p = 0,0199 (18002-1002); a ns p-Werte in der Reihenfolge von links nach rechts: Leber p = 0,1685; 0,8285; >0,999; 0,1818; 0,8041; Milz p = 0,0763; 0,0702; 0,1244; >0,9999; 0,9906; 0,9854; Lunge p = 0,0845; 0,8127; 0,8366; >0,9999; Thymus p = 0,9818; 0,8695; 0,0755; 0,144; 0,9785. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Da die Leber ein wichtiger Ort der FVIII-Produktion ist, wurden die Verteilung und Lokalisierung transplantierter Zellen in diesem Organ auch immunhistochemisch untersucht, wobei ein für das menschliche Kernprotein Ku80 spezifischer Antikörper verwendet wurde, und die Objektträger wurden mithilfe von Bild J quantifiziert (Abb. 5b). . Repräsentative Bilder der Ku80-Färbung in der Leber sind in Abb. 5c – f zu sehen. Ergänzende Abbildung 3 zeigt auch repräsentative Bilder der Ku80-Färbung im Thymus dieser Tiere.

Darüber hinaus und um die Position von PLC-mcoET3 im Lebergewebe und etwaige durch PLC-mcoET3 verursachte histomorphologische Veränderungen an der Transplantationsstelle besser sichtbar zu machen, wurde auch eine Ku80-Färbung mit dem Chromogen 3,3-Diaminobenzidin (DAB) durchgeführt. Die Ku80-positiven dunklen Kerne der menschlichen Zellen können leicht im Parenchym der verschiedenen Leberabschnitte identifiziert werden (Abb. 6c – f). Es gibt weder Hinweise auf eine klonale Proliferation von PLC-mcoET3 noch auf eine Störung der Leberzellarchitektur an der Stelle, an der sich die Zellen angesiedelt haben.

a Repräsentative Bilder (links: Maßstabsbalken = 100 µm und rechts: Maßstabsbalken = 50 µm) der Färbung des humanspezifischen Kernproteins Ku80 (dunkelbraun) in menschlichen Leberschnitten; b Repräsentative Bilder (links: Maßstabsbalken = 100 µm und rechts: Maßstabsbalken = 50 µm) von nicht transplantierten Kontrollschafen, die das Fehlen menschlicher Zellen zeigen; c–f Repräsentative Bilder (links: Maßstabsbalken = 100 µm und rechts: Maßstabsbalken = 50 µm) der Färbung für das menschenspezifische Kernprotein Ku80 in IUTx-Tieren (n = 4 Tiere, jedes Panel ein anderes Tier), die das demonstrieren Anwesenheit menschlicher Zellen. Die dunklen Kerne der menschlichen Zellen sind im Parenchym der verschiedenen Leberabschnitte zu erkennen, ohne Anzeichen einer Störung der Leberzellarchitektur. Objektträger aller Versuchstiere und Negativkontrollen wurden in mindestens drei verschiedenen Experimenten analysiert. Um die Verzerrung des Beobachters zu beseitigen, wurde ein ImageJ-Skript verwendet, um drei verschiedene Regionen von Interesse (ROIs) zu verarbeiten und positive Zellen zu identifizieren. Das Skript entfaltete jedes ROI-Bild in ein H&E-Bild und ein DAB-Bild und berücksichtigte dann positive Zellen anhand von Größe, Zirkularität und Farbschwellenwert. Alle Bilder wurden mit dem Hellfeldmikroskop LEICA DM4000B mit 10-fach- und 20-fach-Objektiven aufgenommen.

Die Produktion und das Vorhandensein von ET3-Protein in der Leber wurden auch beim IUTx HA-Tier bestimmt (Abb. 5g, h). Da Tieren mit dieser Mutation das Faktor-VIII-Antigen fehlt (kreuzreaktives Material negativ) (ergänzende Abbildung 4), resultiert der Nachweis von FVIII/ET3 im IUTx-HA-Tier aus der Produktion von ET3/FVIII durch die im Organ vorhandenen transplantierten Zellen. Bemerkenswert ist das Vorhandensein von ET3/FVIII-produzierenden Zellen zwischen den Hepatozyten und verflochten mit den Lebersinusoiden. Ergänzende Abbildung 5 zeigt ET3/FVIII-positive Zellen, die sich im Thymus des HA-Tieres befinden.

Die FVIII-Aktivität im Plasma von IUTx-Tieren blieb im dritten Jahr der Analyse erhöht, was darauf hindeutet, dass PLC-mcoET3 langfristig in den transplantierten Geweben persistiert. Um zu überprüfen, ob PLC-mcoET3 langfristig in den verschiedenen Organen vorhanden war, wurden sechs Tiere, die keine HA-Träger oder männlichen Züchter waren, 2,3–5 Jahre nach IUTx eingeschläfert (Ergänzungstabelle 1). qPCR unter Verwendung human-Alu-spezifischer Primer auf aus Leber, Lunge, Milz und Thymus extrahierter DNA wurde wie oben beschrieben durchgeführt und die in Abb. 7a–e gezeigten Ergebnisse zeigen, dass in den meisten analysierten Organen immer noch menschliche DNA vorhanden war. Die gleichen Gewebeproben, die von nicht behandelten Kontrolltieren entnommen wurden, zeigten keine Zielamplifikation. Um zu bestätigen, dass die nachgewiesene menschliche DNA transplantierten menschlichen Zellen entsprach, und um deren Position zu bestimmen, wurden Gewebeschnitte aus der Leber dieser Tiere auch mittels Immunhistochemie untersucht, wobei Antikörper verwendet wurden, die spezifisch für das menschliche Kernprotein Ku80 und menschliches Albumin sind. Repräsentative Bilder von Lebergeweben von Menschen, nicht transplantierten Kontrollschafen und IUTx-Tieren sind in Abb. 7f – k zu sehen. Die dunklen Kerne menschlicher Zellen können in der Nähe der Lebersinusoide leicht identifiziert werden, während keiner der Hepatozyten in den analysierten Objektträgern positiv auf menschliches Albumin ist.

a–e qPCR mit humanen Alu-spezifischen Primern, durchgeführt in dreifacher Ausfertigung an DNA, die 2,3–5 Jahre nach IUTx aus Leber, Lunge, Milz und Thymus (n = 6 Tiere) extrahiert wurde; Menge menschlicher DNA, extrapoliert aus einer Standardkurve bestehend aus Schaf-DNA mit (0,25, 0,5, 1, 5 und 10 ng menschlicher DNA von PLC bis zu insgesamt 100 ng DNA pro Probe) oder ohne menschliche DNA. Alle analysierten Gewebe enthielten menschliche DNA; Dieselben Gewebeproben von nicht behandelten Kontrolltieren zeigten keine Zielamplifikation; b–e Einzelne Daten zum menschlichen DNA-Gehalt in Organen einzelner in (a) dargestellter Tiere; f–k Repräsentative Bilder von Lebergewebeschnitten, die das Vorhandensein/die Lokalisierung menschlicher Zellen durch IHC mit Antikörpern gegen das menschliche Kernprotein Ku80 (dunkelbraun) und menschliches Albumin (rot) bestätigen; f Menschlicher Lebergewebeschnitt, der die positiven dunklen Kerne und das zytoplasmatische Albumin in Rot zeigt; g Nicht transplantierte Schafleber-Kontrolle, die keine dunklen menschlichen Zellkerne oder zytoplasmatisches menschliches Albumin aufweist. h–k Lebergewebeschnitte von IUTx-Tieren (n = 4 Tiere), dunkle menschliche Kerne sind zwischen Hepatozyten in der Nähe von Lebersinusoiden verstreut zu sehen, während keiner der Hepatozyten in den analysierten Objektträgern positiv für menschliches Albumin ist. Objektträger aller Positiv- und Negativkontrollen wurden in drei verschiedenen Experimenten gefärbt und die Testtiere wurden mithilfe von ImageJ-Skripten in mindestens drei verschiedenen ROIs analysiert. Alle Bilder wurden mit einem Hellfeldmikroskop LEICA DM4000B mit einem 20-fach-Objektiv aufgenommen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Zur Bestimmung signifikanter Unterschiede wurde eine einfache ANOVA gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest verwendet und p ≤ 0,05 wurde als signifikant angesehen. **p = 0,0016, ****p = <0,0001, p = 0,7316 Leber-Lunge; p = 0,5619 Leber-Milz; p = 0,1072 Lunge-Milz; p = 0,0713 Milz-Thymus. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um sicherzustellen, dass mcoET3 immer noch von den transplantierten Zellen transkribiert wird, wurde RT-qPCR an aus Leber, Lunge, Thymusdrüse und Milz isolierter RNA unter Verwendung von mcoET3-spezifischen Primern durchgeführt, wie oben beschrieben (ergänzende Abbildung 6a, b – e). Darüber hinaus wurde aus Fortpflanzungsgewebe sowie aus Brust- und Mesenteriallymphknoten isolierte RNA auch mittels RT-qPCR analysiert (ergänzende Abbildung 6a, f – h).

Um zu untersuchen, ob die Transplantation von PLC-mcoET3 in den verschiedenen Geweben unerwünschte Auswirkungen hatte, wurde eine H&E-Färbung an Gewebeschnitten aller eingeschläferten Tiere durchgeführt und die Objektträger an einen zertifizierten Tierpathologen geschickt. Die Ergebnisse zeigten in keinem der untersuchten Gewebe Hinweise auf eine lentivirale oder verfahrensbedingte Toxizität. Darüber hinaus gab es keine Veränderungen in der Gewebearchitektur, der Bildung von ektopischem Gewebe, der groben Tumorentwicklung oder Bereichen mit atypischen Zellen oder Hyperplasie- oder Neoplasieherden. Repräsentative Bilder dieser Gewebeschnitte sind in Abb. 8 zu sehen.

Repräsentative Bilder der H&E-Färbung von Gewebeschnitten von IUTx-Tieren (n = 10 Tiere), die keine Veränderungen in der Gewebearchitektur oder Tumorentstehung zeigen. Alle Bilder wurden mit einem Leica DM4000 B-Mikroskop mit einem 10-fach-Objektiv aufgenommen.

Um zu untersuchen, ob orgelresidentes PLC-mcoET3 Identitäten annahm, die mit bestimmten Zelltypen innerhalb der Organe übereinstimmen, wurde RNA aus den Hauptgeweben der Tiere isoliert und Transkriptom-RNA-seq-Bibliotheken erstellt, die nach Eliminierung möglicher Kreuzungen mit Homo sapiens-Bibliotheken abgeglichen wurden -Reaktivität mit Schaftranskripten. Vor der Transplantation wurde auch RNA aus PLC-mcoET3 isoliert und Transkriptom-RNA-seq-Bibliotheken erstellt. Transkripte des PLC-mcoET3 wurden mit menschlichen Transkripten verglichen, von denen bekannt ist, dass sie in organspezifischen Zellen exprimiert werden, und mit menschlichen Transkripten, die in denselben Organen der transplantierten Tiere gefunden wurden. Die Ergebnisse sind in den Ergänzungstabellen 2–6 zu finden, die menschliche Leber-, Lungen-, Thymus- und Eierstock-/Hoden-spezifische hochregulierte Transkripte darstellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass zwar mehrere zellspezifische Transkripte in jedem Gewebe hochreguliert waren, eine Transkriptomproliferation wie bei einer vollständig differenzierten Zelle jedoch nicht vorhanden war. Wichtig ist, dass diese Analysen auch bestätigten, dass das im Fortpflanzungsgewebe vorhandene PLC-mcoET3 nicht auf den Beitrag dieser transplantierten Zellen zur Keimbahn während der fetalen Entwicklung zurückzuführen ist.

Immunhistochemie unter Verwendung von Antikörpern, die für ausgewählte menschliche Proteine, die durch die hochregulierten Transkripte kodiert werden, spezifisch sind, wurde auch in Leberschnitten der Tiere durchgeführt, die die höchste Anzahl dieser menschlichen Lebertranskripte aufwiesen. Repräsentative Bilder sind in den Abbildungen dargestellt. 7 und 9. Ein repräsentatives Bild von LYVE-1-positiven Zellen im Endothel der Lebersinusoide ist im Detail bei einem der transplantierten Tiere zu sehen (Abb. 9c, d). Während keiner der Hepatozyten in den analysierten Objektträgern positiv für menschliches Albumin ist (Abb. 7h – k), erwiesen sich einige Hepatozyten als positiv für das Harnstoffzyklus-Enzym CPS1, und repräsentative Bilder sind in Abb. 9e – i dargestellt.

ein repräsentatives Bild der LYVE-1-Färbung eines menschlichen Lebergewebeschnitts, das dunkel gefärbte lebersinusoidale Endothelzellen (LSECs) zeigt; Als Referenz sind einige der Sinuskurven mit gepunkteten Linien versehen (Maßstabsbalken = 50 µm); b Repräsentatives Bild der LYVE-1-Färbung eines nicht transplantierten Schaf-Kontrolllebergewebeschnitts, der das Fehlen menschlicher LSECs bestätigt (Maßstabsbalken = 50 µm); c Repräsentatives Bild der LYVE-1-Färbung eines IUTx-Schaflebergewebeschnitts, in dem Transkripte für LYVE-1 gefunden wurden (n = 5 Tiere analysiert), was das Vorhandensein menschlicher LSEC-ähnlicher Zellen zeigt, die LYVE-1 exprimieren (Maßstabsbalken = 100 µm). ); d Vergrößerung des gepunkteten Rechtecks ​​(Maßstabsbalken = 50 µm) in (c) mit detaillierter Darstellung der LYVE-1+-Zellen, die mit schwarzen Pfeilspitzen markiert sind; (e–i) Repräsentative Bilder der Färbung von Lebergewebeschnitten durch das menschliche Harnstoffzyklusenzym CPS1 (rosa) (Maßstabsbalken = 50 µm); e Menschlicher Lebergewebeschnitt mit Hepatozyten, die positiv für CPS1 sind (in Rosa); f Nicht transplantierter Schaf-Kontrolllebergewebeschnitt, der das Fehlen von Hepatozyten bestätigt, die menschliches CPS1 exprimieren; g–i Repräsentative Bilder von Lebergewebeschnitten von IUTx-Tieren, in denen Transkripte für CPS1 gefunden wurden (n = 4 Tiere), die mehrere Hepatozyten zeigen, die positiv für menschliches CPS1 sind. Objektträger aller Positiv- und Negativkontrollen und Testtiere wurden in drei separaten Experimenten mindestens in drei verschiedenen Bereichen analysiert. Alle Bilder wurden mit einem Hellfeldmikroskop LEICA DM4000B aufgenommen.

Die Begeisterung für die Behandlung genetischer Störungen während der Schwangerschaft ist durch die Entwicklung neuartiger Gentransfer- und Genbearbeitungstechnologien, das bessere Verständnis der fetalen Entwicklung und der Wechselwirkungen zwischen Fötus und Mutter, die Fortschritte bei der Sicherheit pränataler Manipulationen und die Fähigkeit zur Herstellung und Verwendung wiederbelebt worden prä-/perinatale Zellen und/oder genmodifizierte Zellen16,17,18,19,20,21,22,23.

Während klinische IUTx-Studien zur Behandlung monogener Erkrankungen initiiert wurden, bei denen die Feten vom Absterben bedroht sind und/oder von der Entwicklung irreversibler Pathologien bedroht sind, wären auch andere Krankheiten ideal für die Behandlung in utero, bei denen eine minimale Korrektur die Erkrankung wesentlich beeinträchtigen würde Auswirkungen auf die zukünftige Lebensqualität (QOL) der betroffenen Personen haben und bei denen es möglich ist, die immunologische Umgebung zum Zeitpunkt der Behandlung auszunutzen, um eine postnatale Immunreaktion auf transgenkodierte Proteine ​​zu verhindern6,9,17,24. Es ist außerdem von entscheidender Bedeutung, dass eine pränatale genetische Diagnose verfügbar und zuverlässig ist und dass die Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp eine langfristige klinische Prognose vorhersagen kann6,9,17,24. Somit ist HA eine ideale Erkrankung zur pränatalen Korrektur, da bei 70 % der PHA eine Familienanamnese mit der Krankheit vorliegt, eine zuverlässige pränatale Diagnose verfügbar ist und die Art der Mutation in Kombination mit der Familienanamnese vorhersagen kann, ob Patienten zur Entwicklung von Inhibitoren neigen. Darüber hinaus kann ein Anstieg von nur 5 % des FVIII im Kreislauf einen lebensbedrohlichen Spontanblutungsphänotyp in einen Phänotyp verwandeln, der für leichte körperliche Aktivität geeignet ist, und ein Anstieg von 5–15 % kann einer risikoreicheren körperlichen Aktivität standhalten Blutungsereignisse treten nur nach schweren Traumata oder Operationen auf8,9,17,25.

Obwohl die neuesten FVIII-Produkte und Therapiepläne, die der PHA zur Verfügung stehen, den Pflegestandard und die Lebensqualität für viele erheblich verbessert haben, gibt es immer noch ungedeckten medizinischen Bedarf, der die Entwicklung neuartiger Therapieansätze erfordert, um die Herausforderungen und Lücken in den Standardbehandlungen zu bewältigen2,26 ,27. Wichtig ist, dass das Ziel einer Heilung unerreicht bleibt. Selbst mit den besten prophylaktischen Behandlungen kommt es beispielsweise immer noch zu Durchbruchblutungen, die zur langfristigen Morbidität beitragen. Der Behandlungsaufwand, insbesondere bei pädiatrischen Patienten, ist eine Realität, da die Behandlungen selbst bei subkutanen Verabreichungswegen immer noch invasiv sind, sowohl physisch als auch psychisch2. Darüber hinaus erfolgt die prophylaktische Behandlung lebenslang und mehr als 30 % der PHA entwickeln FVIII-Hemmer28,29. Wichtig ist, dass sowohl Personen mit schwerem30 als auch nicht schwerem HA31, die Hemmstoffe entwickeln, ein erhöhtes Mortalitätsrisiko haben. Bemerkenswert ist auch, dass es bei einigen Patienten zu spontanen Blutungen kommen kann, die bereits im Neugeborenenalter oder im Säuglingsalter beginnen. Berichten zufolge benötigen 9,5 % der HA-Neugeborenen innerhalb der ersten 24 Stunden nach der Geburt eine Ersatzbehandlung und bei 44 % kommt es innerhalb eines Monats zu einer Blutungsepisode.26,27 Darüber hinaus leiden Säuglinge unter Schädel- (24 %), oralen (30 %), Weichteil- (7 %) und Gelenkblutungen (16,2 %)26,27. Somit könnte bereits ein Anstieg der FVIII-Aktivität um 5 % während der Neugeborenenperiode frühe Blutungsereignisse verhindern. Daher könnten diese Patienten von einer frühzeitigen Intervention stark profitieren.

Klinische Studien an Erwachsenen, die die AAV-Gentherapie (AAV-GT) verwenden, belegen, dass eine Heilung im Erwachsenenalter oder möglicherweise in der späten Adoleszenz mit einer Behandlung vielversprechend ist, aber die im Laufe der Zeit sinkenden FVIII-Spiegel lassen darauf schließen, dass zusätzliche Behandlungen erforderlich sein werden32. Die bereits bestehende AAV-Immunität kann je nach Alter des Spenders und AAV-Serotyp bis zu 60 % betragen, was die Fähigkeit der PHA, solche Therapien zu erhalten, erheblich beeinträchtigt. Entzündungsreaktionen nach AAV-GT führen zu einem Verlust der therapeutischen Wirkung, und die episomale Natur von AAV macht die pädiatrische Anwendung von AAV-GT suboptimal, da die Hepatozytenproliferation während des Leberwachstums zu einer Verdünnung und zum Verlust dieser auf die Leber gerichteten Therapien führen könnte, während dies bei einer erneuten Verabreichung der Fall ist durch die Entwicklung einer Immunität gegen AAV-Komponenten beeinträchtigt33. Darüber hinaus korrelierte die anhaltende Expression der Gerinnungsfaktoren mit der AAV-Vektorintegration, wenn AAV-Vektoren zur Abgabe von FIX und Daher ist die Abgabe von Zellen während der Schwangerschaft, die sich in vivo physiologisch vermehren und klinisch therapeutische FVIII-Spiegel absondern, ein vielversprechender und sicherer Ansatz zur Bereitstellung einer langfristigen/permanenten Korrektur von HA6, da die Transduktion von Zellen in vitro Sicherheitsvorkehrungen in der Produktion ermöglicht, die mit direkter Gabe nicht möglich sind Vektorinjektion und eliminiert das Risiko einer versehentlichen Transduktion unerwünschter Gewebe/Zellen, z. B. der Keimbahn.

IUTx wurde bei menschlichen Patienten sicher durchgeführt, wobei viele Patienten drei Injektionen im Abstand von einer Woche erhielten, was beweist, dass der mehrmalige Zugang zum frühen menschlichen Fötus unter Verwendung eines minimalinvasiven, ultraschallgeführten Ansatzes ein minimales Risiko darstellt34. Wichtig ist, dass die Aktivierung von FX während des fötalen Lebens überwiegend über die Aktivität des Gewebefaktors erfolgt, wodurch sie weitgehend unabhängig vom FIXa/FVIIIa-Phospholipidkomplex ist35. Daher entwickelt sich der Fötus ohne Blutung, selbst wenn wenig oder kein FVIII oder FIX vorhanden ist35,36,37. Die einzigartige Hämostase des Fötus sollte daher eine sichere Durchführung der IUTx bei HA ermöglichen, wie in einer einzelnen Fallstudie gezeigt wurde, in der über den erfolgreichen Ausgang der IUTx bei einem menschlichen Fötus mit schwerer HA berichtet wurde, ohne dass es zu Blutungen kam38. Die Daten deuten auch darauf hin, dass der Empfänger FVIII38 vertragen hat, es wurden jedoch nie Nachuntersuchungen zu diesem Patienten veröffentlicht.

Bemerkenswert ist, dass im Gegensatz zur Hämophilie B nur sehr wenige Tierstudien durchgeführt wurden, um die Wirksamkeit und Sicherheit pränataler Therapien für HA zu testen. In einer Studie wurde Mäusen in der Gebärmutter ein adenoviraler Vektor injiziert, der für FVIII kodiert. Therapeutische Werte wurden am zweiten Lebenstag beobachtet, aber die FVIII-Werte waren am 15. Tag um das Siebenfache gesunken und waren am 2139. Tag verschwunden. Kürzlich führten andere Forscher am Embryonaltag 14,5 eine IUTx bei Wildtyp-Mausfeten unter Verwendung von FVIII-transduzierten Plazentazellen durch Die Evaluierung der Empfänger erfolgte jedoch nur anhand der GFP-Expression, und der FVIII-Spiegel im Blutkreislauf oder die immunologischen Konsequenzen des Ansatzes wurden nicht untersucht40.

Hier berichten wir über Langzeitdaten zur Sicherheit und Wirksamkeit der Abgabe von Zellen, die zur Sekretion von fVIII/ET3 in klinisch relevanten Dosen in einem Großtiermodell von IUTx entwickelt wurden. Da das Gewicht fötaler Schafe zum Zeitpunkt der IUTx mit dem von Menschen zu Beginn der Trächtigkeit vergleichbar ist und im Erwachsenenalter dem von Menschen entspricht oder dieses übersteigt, wäre bei der Übertragung in die Klinik keine Erhöhung der Zelldosis erforderlich Diese Therapien gelten als sicher. Darüber hinaus gewährleistet die Ähnlichkeit des Gesamtplasmavolumens zwischen Menschen und Schafen, dass die langfristigen therapeutischen Werte der FVIII-Aktivität, die im Plasma von IUTx-Tieren nach der Geburt gefunden werden, mit denen beim Menschen vergleichbar wären, da sowohl Menschen als auch Schafe insgesamt einen exponentiellen Anstieg erfahren Plasmavolumen vom fetalen Leben bis zum Erwachsenenalter. Die Daten in dieser Studie zeigen, dass die Verabreichung von PLC-mcoET3 in einer Menge von 16–18 GW beim Menschen zu einer erhöhten Plasma-FVIII-Aktivität führte, die die von Kontrolltieren ohne IUTx um > 48,4 ± 12,3 % überstieg, und zwar für > 3 Jahre nach der Geburt . Die durch FVIII-Aktivitätstests ermittelten FVIII-Aktivitätsniveaus wurden auch durch LC-MS bestätigt, was zusätzlich zeigte, dass ET3-Protein im Plasma der behandelten Tiere vorhanden war. Darüber hinaus unterschieden sich die FVIII-Spiegel ein Jahr nach der IUTx bei sieben von acht Tieren nicht wesentlich von denen drei Jahre nach der IUTx, und bei dem einen Tier, bei dem die FVIII-Spiegel zurückgingen, blieben die FVIII-Spiegel immer noch >5 % über dem Normalwert . Interessanterweise wurden bei Tieren, die höhere Zelldosen erhielten, oder bei Zellen mit höherer FVIII-Sekretion keine höheren FVIII-Plasmaspiegel festgestellt. Wichtig ist, dass keines der behandelten Tiere Anti-FVIII/ET3-IgM oder IgGs oder ET3-spezifische Th1- oder Th2-Zellen entwickelte. Dies steht im Gegensatz zu dem, was in einer anderen Studie mit jungen Schafen berichtet wurde, die genau die gleiche Therapie (PLC-mcoET3) über den gleichen Verabreichungsweg (IP) erhielten und in der 66 % der Tiere Anti-FVIII/ET3-IgGs und niedrige Werte entwickelten Titer von Anti-FVIII- und Anti-ET3-inhibitorischen Antikörpern13.

Interessant ist auch, dass mit IUTx behandelte Empfänger keine Immunität oder Anti-HLA-Antikörper gegen das transplantierte menschliche PLC entwickelten, aber eine robuste Reaktivität gegenüber fremden Antigenen beibehielten. Darüber hinaus waren die hämatologischen Parameter und Leberenzyme normal, was das Fehlen jeglicher Lebertoxizität bewies. Es wurde festgestellt, dass sich PLC-mcoET3 in allen wichtigen analysierten Organen festsetzt, ohne dass es zu histopathologischen Veränderungen kommt, und die Auswertung der mcoET3-Expression durch RT-qPCR und der menschlichen genomischen DNA durch qPCR in denselben Geweben bestätigte nicht nur die langfristige Transplantation der transplantierten Zellen , zeigte aber auch die fortgesetzte Transkription des Transgens.

Bemerkenswert ist, dass die RNA-seq-Analyse zur Identifizierung von Veränderungen im Transkriptom von transplantiertem PLC-mcoET3 vor der Transplantation zu dem eines Transkriptoms, das mit dem eines organspezifischen Zelltyps vergleichbar ist, zeigte, dass diese Zellen zwar mehrere Transkripte hochregulierten, diese Zellen jedoch nie Sätze exprimierten Gene, die denen differenzierter Zellen entsprechen. Da die Leber von Schafen etwa 1 kg wiegt, ist es unmöglich, die Möglichkeit der Existenz vollständig differenzierter Zellen absolut auszuschließen. Dennoch ist es wichtig zu beachten, dass dieselben Regionen Zellen enthielten, die positiv für das menschliche Kernprotein Ku80 waren. Insgesamt zeigen die Daten, dass transplantiertes PLC-mcoET3 einige Transkripte exprimiert und einige der Proteine ​​des Gewebes produziert, in dem sie sich ansiedeln, das Vorhandensein einer voll funktionsfähigen differenzierten organspezifischen Zelle jedoch nicht bestätigen kann.

Die Studie zeigt auch, dass es innerhalb der analysierten Proben signifikante Unterschiede im Grad der PLC-mcoET3-Transplantation in den verschiedenen Organen und zwischen Tieren gab. Selbst wenn mehrere Proben von jedem Tier/Organ analysiert würden, ist es aufgrund des großen Volumens der Organe schwierig festzustellen, ob es möglich ist, diese Ergebnisse auf die Gesamtheit der Organe zu extrapolieren. Der beste Indikator für das Ergebnis der Therapie sind daher die im Plasma dieser Tiere nachgewiesenen FVIII-Aktivitätswerte, die tatsächlich die Gesamtproduktion von FVIII durch die transplantierten Zellen messen können.

Ein Hauptziel ist auch die Bescheinigung der Sicherheit des Verfahrens und der Therapie. In dieser Studie gingen Tiere aus Gründen verloren, die nichts mit der Behandlung oder dem IUTx-Verfahren zu tun hatten. Hierzu zählen auch die Spätaborte bei HA-geklonten Tieren, da dieses Problem nach dieser Art der assistierten Reproduktionstechnologie gut dokumentiert ist und nicht auf die Transplantation selbst zurückzuführen ist41. Da zu Beginn dieser Studien die Träger in der HA-Schafkolonie bereits alt waren und das Klonen zu Fehlgeburten führte, konnten wir durch natürliche Zucht leider nicht viele HA-Tiere züchten. Das eine mit IUTx behandelte HA-Tier wurde aufgrund von Wehen- und Entbindungskomplikationen tot geboren. Trotz des traumatischen Geburtsvorgangs zeigte das Tier jedoch bei der Autopsie keine Anzeichen der abnormalen Blutung, die in dieser Linie von HA-Tieren beobachtet wird14,15, und ET3/FVIII-produzierende Zellen wurden in der Leber und im Thymus dieses Tieres identifiziert .

Somit belegen diese Studien die Machbarkeit, den immunologischen Vorteil und die Sicherheit der Behandlung von HA vor der Geburt. Von Bedeutung ist, dass IUTx mit PLC-mcoET3 die Notwendigkeit einer wöchentlichen Dosierung überflüssig machen und gleichzeitig therapeutische Werte beibehalten könnte, die über dem neuen vorgeschlagenen klinischen Ziel von >15 % FVIII liegen, das einen wirksamen Schutz vor den meisten spontanen Blutungen bieten soll25. Da die durchschnittlichen FVIII-Plasmaspiegel 3 Jahre nach der IUTx 48,4 ± 12,3 % über der Kontrolle lagen, könnte dieser Ansatz auch genügend Faktoren liefern, um andere akute Blutungen zu kontrollieren, insbesondere subklinische Blutungen und solche im Zusammenhang mit Traumata, Operationen und/oder oder intensive körperliche Aktivität25. Dennoch ist die Bestätigung der phänotypischen Korrektur durch die Bewertung, ob die jährliche Blutungsrate im Laufe des Lebens von HA-Tieren gegenüber dem Ausgangswert signifikant reduziert ist, und der Nachweis, dass bei diesen Tieren immer noch keine Immunantwort vorhanden ist, ein Muss, um die tatsächlichen klinischen Auswirkungen dieser pränatalen Erkrankung festzustellen Ansatz.

Alle Untersuchungen wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften sowie Tierversuchen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Wake Forest University School of Medicine genehmigt wurden. Entsorgte menschliche Plazenten wurden aus Vollzeitgeburten nach schriftlicher Einverständniserklärung und Entschädigung für ihre Zeit gemäß den Richtlinien des Office of Human Research Protection gewonnen und vom Institutional Review Board (IRB) der Wake Forest University School of Medicine genehmigt.

Alle Verfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Wake Forest University School of Medicine genehmigt. Alle Versuchsschafe sind eine Mischung aus Alpenweiß-, Suffolk-, Rambouillet- und Merinostämmen und werden auf umzäunten Weiden mit Zugang zu Unterständen und/oder Ställen in der Großtieranlage der Wake Forest University School of Medicine unter der tierärztlichen Obhut des Tieres gehalten Ressourcenprogramm (ARP). Schafe werden mit Wasser, der Jahreszeit und dem Trächtigkeitsstatus entsprechendem Futter sowie Nahrungsergänzungsmitteln wie Vitamin E, Selen und Kalzium versorgt. Lämmer erhalten das Kolostrum der Mutter oder künstliches Kolostrum und werden bei Bedarf mit der Flasche gefüttert. Schafe werden regelmäßig von ARP-Tierärzten und/oder Veterinärtechnikern geimpft und untersucht, um den Gesundheits- und Ernährungszustand der Herde sicherzustellen. Fetalen Schafen (n = 25), männlichen und weiblichen, wurde PLC-mcoET3 intraperitoneal bei 59–65 gd (Vollzeitschwangerschaft: 145–150 Tage) injiziert, was einer Trächtigkeitswoche von ~16–18 beim Menschen entspricht ultraschallgeführte transabdominale perkutane Injektion unter Verwendung einer echogenen Spinalnadel mit 22 Gauge und 152 mm (Hakko Co, 6PTC22), wie zuvor berichtet42, bei Zelldosen von 107–4 × 108 Zellen/kg in 500 ul QBSF-60 (Quality Biologicals Inc . NC0823508). Obwohl HA eine X-chromosomale Erkrankung ist und vorwiegend Männer betrifft, wurde das Produkt hier sowohl Männern als auch Frauen verabreicht. Von den 25 transplantierten Tieren standen 13 für eine Langzeituntersuchung (bis zu 1 Jahr) zur Verfügung und acht dieser Tiere wurden bis zu 3 Jahre lang beobachtet; vier wurden erst kurz nach der Geburt (ca. 3 Monate nach der Transplantation) ausgewertet, während acht für die Studie verloren gingen. Bei allen verstorbenen/euthanasierten Tieren traten medizinische Komplikationen auf, die nichts mit dem Verfahren und/oder der Produktverabreichung zu tun hatten. Bei der Beurteilung der Behandlungswirksamkeit wurden die Tests blind für den Behandlungsstatus der Tiere durchgeführt. Um die statistische Signifikanz sicherzustellen, wurden die Tierzahlen durch Leistungsanalysen mit G*Power v3.1.9.2 bestimmt.

Weitere Informationen zum Studiendesign, allen Forschungsmethoden und Ergebnissen finden Sie in der Ergänzungstabelle 1 und den Ergänzungsmaterialien.

Plazentazellen wurden isoliert, kultiviert, mit einem lentiviralen Vektor transduziert, der für mcoET3 kodiert, ein humanes myeloisches Codon-optimiertes, biotechnologisch hergestelltes FVIII-Transgen, das Elemente mit hoher Expression aus Schweine-FVIII12 enthält, und auf FVIII-Produktion, Phänotyp, Lebensfähigkeit/Funktion, genomische Stabilität usw. analysiert Immunogenität wie zuvor beschrieben11 und detailliert in der Ergänzungstabelle 1. Das in dieser Studie verwendete PLC-mcoET3 erfüllte die Kriterien eines VCN < 5 und einer Produktion von FVIII/10^6 Zellen/24 h > 5 IE.

Das Blut wurde in Natriumcitratröhrchen (BD Biosciences, 369714) gesammelt und das Plasma durch 30-minütige Zentrifugation bei 400 × g isoliert und bis zur Durchführung der aPTT-Tests bei –80 ° C gelagert. aPTT-Tests wurden vom Wake Forest Baptist Medical Center Special Hematology Laboratory unter Verwendung klinischer Standardverfahren durchgeführt. Kurz gesagt, Standard-Referenzplasma wurde durch Zusammenführen des Plasmas einer großen Anzahl (z. B. 40) normaler, gesunder Freiwilliger hergestellt und erhielt einen Wert von 100 % FVIII-Spiegel. Anschließend wurden Reihenverdünnungen dieses Referenzplasmas in FVIII-defizientem Plasma hergestellt, um eine Standardkurve mit Werten von 100, 50, 33, 25, 12,5, 10 und 1 % der normalen FVIII-Spiegel zu erstellen. Dieses normale menschliche Referenzplasma, Plasma von transplantierten Tieren und gepooltes Plasma von 4–6 nicht transplantierten Kontrollschafen, die untersucht werden sollten, wurden mit dem FVIII-defizienten Plasma gemischt und die Standards und Proben wurden auf einem klinischen Koagulometer ACL Top 300 CTS analysiert (Instrumentation Laboratories, 00000280060). Die Ergebnisse wurden dann auf Log-Lin-Papier aufgetragen, wobei die Verdünnungen auf der logarithmischen X-Achse und die Gerinnungszeiten auf der linearen Y-Achse aufgetragen wurden. Von der Verdünnung, die 100 IU/dl (100 %) ergab, wurde eine vertikale Linie gezogen. Wo diese Linie die Linie der besten Anpassung für den Referenzplasmastandard schnitt, wurde eine Linie im rechten Winkel dazu gezogen, bis sie die zu untersuchende überstehende Probe schnitt. Anschließend wurde eine vertikale Linie gezogen, bis sie die X-Achse schnitt, um den FVIII-Spiegel bei den normalen und den transplantierten Schafen festzustellen.

Alle Tests wurden unabhängig vom Behandlungsstatus der Tiere durchgeführt. Der prozentuale Anstieg der FVIII-Aktivität gegenüber einem Pool normaler Kontrollschafe wurde unter Verwendung von Gleichung berechnet. (1).

Um das Vorhandensein von ET3 und hFVIII im Plasma transplantierter Tiere zu bestätigen, wurde eine Proteinverdau-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS) blind durchgeführt, wie unten beschrieben. Der Scaffold-DIA-Normalisierungsalgorithmus zur Intensitätsquantifizierung wurde angewendet, um die Werte zu Vergleichszwecken entsprechend anzupassen. Aufsummierte Intensitäten aus verschiedenen MS-Proben wurden zunächst log10-transformiert und für jede Probe wird ein Histogramm erstellt. Für jede Probe wurden Vierteljahre berechnet und mit den Vierteljahren des gesamten Experiments verglichen. Die exklusive Intensität stellt den zusammengefassten Intensitätswert nur der Peptide dar, die mit diesem Protein assoziiert sind.

Der Proteingehalt von Plasmaproben wurde mithilfe des fluoreszenzbasierten Proteintests EZQ (Invitrogen #R33200) geschätzt. 100 μg Proteinextrakte wurden reduziert, mit Iodacetamid alkyliert und mit einer Trypsin/Lys-C-Protease-Mischung unter Verwendung des Thermo Scientific EasyPep Mini MS Probenvorbereitungskits (Kat.-Nr. A40006) gemäß dem bereitgestellten Protokoll verdaut. Zur Verdauung wurde Trypsin/Lys-C im Verhältnis 1:10 (Enzym:Protein) zugegeben. Die Proben wurden zur Analyse mithilfe der im Kit enthaltenen Säule gereinigt und in 100 μl 0,1 %iger Ameisensäure in Wasser rekonstituiert, sodass eine Endkonzentration von 1 μg/μl für die Analyse entstand.

Die Proben wurden mit einem UltiMate 3000 RSLCnano-System (Thermo Scientific, San Jose, CA) analysiert. Die Peptide wurden vor der Trennung auf einer C18 PepMap 100-Falle mit 300 μm Innendurchmesser × 5 mm (Thermo Scientific, San Jose, CA) für 5 Minuten bei 10 μl/min eingefangen. Die Trennung wurde auf einer 50-cm-uPAC-C18-Nano-LC-Säule (PharmaFluidics, Gent, Belgien) auf einer EasySpray-Quelle (Thermo Scientific, San Jose, CA) durchgeführt, die mit einem Edelstahlemitter mit 30 μm ID (PepSep, Marslev, Dänemark) ausgestattet war. Die Trennung wurde bei 350 nl/min unter Verwendung eines Gradienten von 1–45 % für 60 Minuten durchgeführt (Lösungsmittel A: 0,1 % Ameisensäure; Lösungsmittel B: Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure).

Die datenunabhängige Analyse (DIA) wurde unter Verwendung eines Eclipse Tribrid Orbitrap-Massenspektrometers (Thermo Scientific, San Jose, CA)43,44 mit einer chromatographischen Bibliothek durchgeführt, wie von Searle et al.45 beschrieben. Kurz gesagt, sechs Gasphasenfraktionen (GPF) des biologischen Probenpools wurden zur Erstellung einer Referenzbibliothek verwendet. Bei der GPF-Erfassung wurden 4 m/z-Vorläuferisolationsfenster in einem gestaffelten Muster verwendet (GPF1 398,4–502,5 m/z, GPF2 498,5–602,5 m/z, GPF3 598,5–702,6 m/z, GPF4 698,6–802,6 m/z, GPF5 798,6 –902,7 m/z, GPF6 898,7–1002,7 m/z) bei einer Auflösung von 60.000, das AGC-Ziel wurde auf „Benutzerdefiniert“ mit einem normalisierten Ziel von 1000 % eingestellt, die maximale Injektionszeit wurde auf „dynamisch“ mit mindestens neun Punkten über den Peak eingestellt und ein NCE von 33 unter Verwendung der Kollisionsdissoziation mit höherer Energie (HCD). Biologische Proben wurden mit einem identischen Gradienten wie die GPFs unter Verwendung eines gestaffelten Fensterschemas von 8 m/z über einen Massenbereich von 385–1015 m/z untersucht. Die Vorläuferisolierung wurde im Orbitrap mit einer Auflösung von 60.000 mit einer dynamischen Maximalinjektion durchgeführt, die mindestens neun Punkte über den Peak ermöglichte, einer benutzerdefinierten AGC, die auf 1000 % normalisiert wurde, und einem NCE von 33 unter Verwendung von HCD. Die artspezifische FASTA-Datenbank für Ovis aries (UP000002356) mit 23.111 Proteinen wurde von Uniprot heruntergeladen. Eine empirisch korrigierte Bibliothek, die das GPF und das tiefe neuronale Netzwerk Prosit46 kombiniert, wurde verwendet, um vorhergesagte Fragmente und Retentionszeiten zu generieren. Die ET3-Sequenz wurde zum Ovis aries UP000002356 FASTA hinzugefügt, in ein Prosit-kompatibles CSV-Format konvertiert und an Prosit übermittelt. Die konvertierte Prosit-Datei wurde anschließend in das EncyclopeDIA DLIB-Format konvertiert. ScaffoldDIA (Proteome Software, Portland, OR) erstellte unter Verwendung der Ovis aries UP000002356 DLIB eine empirisch korrigierte Bibliothek unter Verwendung der GPF-DIA-Injektionen. DIA-MS-Proben wurden mit Scaffold DIA (3.1.0) analysiert. DIA-MS-Datendateien wurden mit ProteoWizard (3.0.19254)47 in das mzML-Format konvertiert. Es wurde eine Dekonvolution versetzter Fenster durchgeführt. Die Proben wurden anhand der Retentionszeiten abgeglichen und einzeln gegen Sheep_ET3.elib mit einer Peptid-Massentoleranz von 10,0 ppm und einer Fragment-Massentoleranz von 10,0 ppm durchsucht. Berücksichtigte variable Modifikationen waren: Carbamidomethylierung C. Das Verdauungsenzym war Trypsin mit maximal einer fehlenden Spaltstelle. Berücksichtigt wurden Peptide mit Ladungen von 2–3 und einer Länge von 6–30 Aminosäuren. Die in jeder Probe identifizierten Peptide wurden mit dem Perkolator (3.01.nightly-13-655e4c7-dirty)48,49,50 gefiltert, um einen maximalen FDR von 0,01 zu erreichen. Einzelne Suchergebnisse wurden kombiniert und den Peptididentifikationen wurden Posterior-Fehlerwahrscheinlichkeiten zugewiesen und durch Percolator auf einen FDR-Schwellenwert von 0,01 gefiltert. Die Peptidquantifizierung wurde von Encyclopedia (1.2.2) durchgeführt. Für jedes Peptid wurden die 5 Fragmentionen höchster Qualität zur Quantifizierung ausgewählt. Proteine, die ähnliche Peptide enthielten und anhand der MS/MS-Analyse nicht unterschieden werden konnten, wurden gruppiert, um den Grundsätzen der Sparsamkeit zu genügen. Für die Proteingruppen wurde ein Schwellenwert festgelegt, um einen Protein-FDR <1,0 % zu erreichen.

Blindtests für Aspartataminotransferase (AST) und Alaninaminotransferase (ALT) wurden vom Cornell University Animal Health Diagnostic Center durchgeführt. Normalwerte für AST und ALT bei Schafen liegen bei <280 bzw. <50 U/L. Zur Bestimmung der Leukozytenzahl/ml wurde Vollblut mit dem LeukoCheck-Testkit (Biomedical Polymers 21243285) verwendet. Der Hämatokritwert wurde vom Veterinärpersonal bestimmt.

Hochbindende Platten (Corning, 9018) wurden wie zuvor beschrieben mit ET3-Protein beschichtet51. Schafplasmen wurden seriell verdünnt, beginnend mit einer Verdünnung von 1:20, und die Antikörperbindung wurde mit Anti-Schaf-IgG:ALP (Bio-Rad STAR88A) oder Anti-Schaf-IgM:ALP (AbCam, AB112761) und p-Nitrophenylphosphat nachgewiesen ( Bio-Rad, 1721063). Der Antikörpertiter wurde als Verdünnung von Plasma mit einem Extinktionswert > 2 SD über der mittleren OD aus Kontrollschafplasma (n = 4) definiert. Ergänzende Abb. 7a, b.

Um den Grad der Transplantation von mcoET3-PLC bei IUTx-Empfängern zu quantifizieren, wurde RT-qPCR mit dem Echtzeit-PCR-System QuantStudio 6 Flex von Applied Biosystems durchgeführt. Gewebeproben von IUTx-Empfängern wurden aus Leber, Lunge, Thymusdrüse, Milz, Gehirn, Nieren, Bauchspeicheldrüse und Darm entnommen und in RNAlater (Qiagen, AM7020) konserviert. Die RNA wurde isoliert und unter Verwendung des Omniscript RT-Kits (Qiagen, 205113) gemäß den Anweisungen des Herstellers in cDNA umgewandelt. RT-qPCR wurde unter Verwendung von 10 ng cDNA/Probe, dem TB Green Advantage qPCR Premix (Takara Bio, 639676) und spezifischen Primern für Schaf-GAPDH (Housekeeping-Gen) und mcoET3 (Fwd Primer: GCAGGGATGTCCACCACATT; Rev Primer: GTATGGACAGTGGGCACCAA) in Endkonzentrationen durchgeführt von 200 nM bzw. 350 nM. Die aus den Gewebeproben erhaltenen rohen Ct-Werte wurden unter Verwendung des Ct-Werts für das Housekeeping-Gen normalisiert, um ΔCt zu erhalten. Der Prozentsatz der Transplantation wurde durch Vergleich von ΔCt mit einer Standardkurve bestimmt, die aus zunehmenden Prozentsätzen von mcoET3-PLC (0, 0,01, 0,1, 1, 5 und 10 %) in Stromazellen (MSCs) von Schafen besteht.

Um die in verschiedenen Organen vorhandenen mcoET3-PLC-Spiegel zu quantifizieren, wurde qPCR wie zuvor beschrieben52 unter Verwendung des Applied Biosystems QuantStudio 6 PCR-Systems durchgeführt. Gewebeproben wurden aus Leber, Lunge, Milz und Thymus entnommen und in Allprotect Tissue Reagent (Qiagen, Katalog-Nr. 76405) konserviert. Die DNA wurde mit dem DNEasy Blood and Tissues Kit (Qiagen, Katalog-Nr. 69504) gemäß den Herstellerangaben isoliert. qPCR wurde unter Verwendung von 100 ng gDNA pro Probe, mit TaqMan Universal Master Mix (ThermoFisher, Katalog-Nr. 4440043) und Primern durchgeführt, die für das Human Alu-Ziel entwickelt wurden (Forward Primer: 5′-GGTGAAACCCCGTCTCTACT-3′) (Reverse Primer: 5′) -GGTTCAAGCGATTCTCCTGC-3′) und eine Hydrolysesonde (5′-CGCCCGGCTAATTTTTGTAT-3′), markiert mit Reporter 6-FAM und Quencher BHQ1. Die Arbeitskonzentration des Primers und die Arbeitskonzentration der Hydrolysesonde betrugen 0,2 bzw. 0,25 µM. Es wurde eine Standardkurve erstellt, die aus Schaf-DNA ohne menschliche DNA oder Schaf-DNA bestand, die mit zunehmenden Mengen (0,25, 0,5, 1, 5 und 10 ng) menschlicher DNA aus PLC bis zu einer Gesamtmenge von 100 ng DNA pro Probe versetzt wurde . Jede Probe wurde unter den folgenden PCR-Bedingungen dreifach ausgewertet; 1 Zyklus mit 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 50 Zyklen mit 95 °C für 15 Sekunden, 56 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden. Für jeden Lauf war eine No-Template-Kontrolle enthalten.

RNA, die aus (1) einem Aliquot des transplantierten mcoET3-PLC, (2) aus verschiedenen Geweben von Schafen, die in utero transplantiert wurden, und (3) denselben Geweben von nicht transplantierten Kontrollschafen extrahiert wurde, wurde mit einem NanoDrop quantifiziert 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc.) und die RNA-Integrität wurde mit dem Bioanalyzer RNA 6000 Nano Assay und dem 2100 Bioanalyzer (Agilent) bewertet. Alle RNA-Proben wurden dann zur Konstruktion der RNA-seq-Bibliothek und Illumina NGS an Qiagen geschickt. Vollständige Transkriptom-RNA-seq-Bibliotheken wurden mit dem QIAseq UPXome RNA Lib Kit HMR (Qiagen Katalog-Nr. 334705) nach dem Standardprotokoll des Herstellers erstellt. Kurz gesagt, die Gesamt-RNA wurde einer ribosomalen RNA (rRNA)-Unterdrückung unter Verwendung des QIAseq FastSelect rRNA-Entfernungskits HMR (Qiagen-Katalog-Nr. 334386) unterzogen und dann unter Verwendung von Zufallshexameren und Oligo-dT-Primern 90 Minuten lang bei 42 °C revers in cDNA transkribiert. Während der cDNA-Synthese erhält jede Probe eine eindeutige Proben-ID, die das Zusammenführen von cDNA ermöglicht. Alle nachfolgenden Schritte zur Bibliothekskonstruktion der gepoolten Proben wurden in einem einzigen Röhrchen durchgeführt, um Chargeneffekte zu minimieren. Nach dem cDNA-Pooling wurden zwei Runden der Perlenauswahl/Reaktionsreinigung mit QIAseq-Perlen (Qiagen-Katalog-Nr. 1107149) durchgeführt. Die cDNA wurde dann mit Unique-Dual-Probenindizes unter Verwendung des QIAseq UX 12 Index Kit IL UDI (Qiagen Katalog-Nr. 331801) amplifiziert.

Die fertigen Bibliotheken wurden dann mithilfe von zwei Runden Bead-basierter Bereinigung mit QIAseq-Beads gereinigt. Die endgültigen Bibliotheken wurden mit einem Agilent Bioanalyzer qualitätskontrolliert und durch Echtzeit-qPCR mit dem QIAseq Library Quant Assay Kit (Qiagen-Katalog-Nr. 333314) quantifiziert und mit einem Illumina Next-Seq 500 unter Verwendung einer 75-Basenpaar-Endsequenzierung mit NextSeq 500/550 sequenziert Kit mit mittlerer Leistung (150 Zyklen).

FASTQ-Dateien wurden auf das QIAGEN RNA-seq Analysis Portal (https://geneglobe.qiagen.com/us/analyze/) hochgeladen und mit der Analyse-Workflow-Version 1.0 auf Homo sapiens (GRCh38.noalt.103) abgeglichen. (https://resources.qiagenbioinformatics.com/manuals/rnaanalysisportal/current/index.php?manual=QIAseq_UPXome_RNA_Lib_Kit.html).

RNA-seq-Bibliotheken wurden mit Homo-sapiens-Bibliotheken abgeglichen, nachdem jegliche mögliche Kreuzreaktivität mit Schaf-Transkripten ausgeschlossen wurde. Anschließend verglichen wir die Transkripte des transduzierten mcoET3-PLC vor der Transplantation mit menschlichen Transkripten, von denen bekannt ist, dass sie in bestimmten Zellen in verschiedenen Organen exprimiert werden.

Um die Position von mcoET3-PLC in Geweben zu bestimmen, wurde eine IHC-Färbung in in Paraffin eingebetteten Geweben durchgeführt, die von den vier bei der Geburt analysierten Tieren entnommen wurden. Leber, Lunge, Milz und Thymus wurden mit einem Antikörper gegen das menschenspezifische Kernantigen Ku80 (Cell Signaling Technologies, 2753S) und einem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG Alexa-Fluor 594 (Life Technologies, A11012) gefärbt. Um menschliches FVIII/mcoET3 in einem HA-Tier nachzuweisen, wurde ein primärer Antikörper verwendet, der auf die C2-Domäne von menschlichem FVIII abzielt (Sekisui Diagnostics, ESH-8), und mit einem sekundären Antikörper Ziegen-Anti-Maus-IgG AF-594 (Life Technologies, A11032). Positive Gewebekontrollen (menschliche Gewebe) und negative Gewebekontrollen (Nicht-IUTx-Schafgewebe) wurden parallel zu jedem durchgeführten Experiment gefärbt und ausgewertet, wobei experimentelle Gewebeobjektträger ausgewertet wurden. Konfokale Bilder wurden mit einem konfokalen Olympus Fluoview FV1000-Mikroskop und einem Olympus UPlanFLN-40x/1,30-Ölobjektiv aufgenommen.

Um PLC-mcoET3 in Geweben zu identifizieren und gleichzeitig die Gewebemorphologie zu visualisieren, verwendet IHC chromogene Nachweismethoden und Antikörper gegen das humanspezifische Kernantigen Ku80 (Cell Signaling Technologies, 2180), das menschliche Harnstoffzyklusenzym CPS1 (HepPar1) (Thermo Fisher, Katalog-Nr . MSM4-966-P1), Anti-Human-LYVE1 (AbCam, Katalog-Nr. ab219556) und Anti-Human-Albumin (ThermoFisher, Katalog-Nr. MA1-19174). Konkret wurde nach der Entparaffinierung und Rehydrierung des Gewebes die Antigengewinnung (EDTA-Puffer, pH 6,0) mit einem automatisierten IHC-Prozessor durchgeführt. Die Gewebe wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers mit BLOXALL-Blockierungslösung (Vector Laboratories, SP-6000) und MAXBlock-Blockierungsmedium (Active Motif, 15252) blockiert. Die Färbung wurde mit einem Kaninchen-Anti-Human-Ku80-Antikörper (Cell Signaling Technologies, 2180) durchgeführt, in MAXBind-Färbelösung (Active Motif, 15253) verdünnt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Der Sekundärantikörper war ein Hühner-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Novus Biologicals, NBP1-75267), der in MAXBind-Färbelösung verdünnt und 1 Stunde bei RT inkubiert wurde. Das VECTASTAIN Elite ABC-Reagenz (Vector Laboratories, PK-6100) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, gefolgt von einer Inkubation im ImmPACT DAB-Reagenz (Vector Laboratories, SK-4105), bis sich eine Farbe entwickelte, und die Reaktion wurde mit entionisiertem Wasser gestoppt. Die Objektträger wurden mit Wasser gewaschen und eine Hämatoxylin-Gegenfärbung aufgetragen. Um LYVE-1- oder Harnstoffzyklus-Enzym CPS1-positive Zellen zu identifizieren, wurden Gewebeobjektträger einer Antigengewinnung (Tris-basierter Puffer, pH 9,0) mit einem automatisierten IHC-Prozessor und einer Blockierung mit BLOXALL-Blockierungslösung (Vector Laboratories, SP-6000) und MAXBlock-Blockierung unterzogen Medium (Active Motif, 15252) gemäß Herstellerangaben. Als Primärantikörper wurden ein Kaninchen-Anti-Human-LYVE1 (AbCam, ab219556), 1:1000 in MAXBind-Färbelösung (Active Motif, 15253) verdünnt, oder ein Maus-Anti-Human-CPS1 (HepPar1)-Antikörper (Thermo Fisher, MSM4-966-P1) verwendet ), verdünnt in MAXBind-Färbelösung (Active Motif, 15253). Ersteres wurde über Nacht bei 4 °C inkubiert, letzteres 1 Stunde bei RT gemäß Herstellerangaben. Sekundärantikörper waren Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, konjugiert an ein HRP-Enzym (AbCam, ab214880), in einer vorverdünnten, gebrauchsfertigen Konzentration, 10 Minuten bei RT inkubiert und Anti-Maus-IgG-Antikörper, konjugiert an ein AP-Enzym ( Vector Laboratories, MP-7714). Nach dem Waschen wurden ImmPACT DAB Peroxidase Substrate (Vector Laboratories, SK-4105) oder ImmPACT Vector Red Substrate (Vector Laboratories, MP-7714) hinzugefügt und 2 Minuten bei RT inkubiert. Die Objektträger wurden sofort mit Wasser gewaschen und anschließend eine Hämatoxylin-Gegenfärbung aufgetragen. Gewebeobjektträger wurden mit einem Deckglas versehen und mit 20-facher Vergrößerung unter Verwendung eines LEICA DM4000B-Hellfeldmikroskops abgebildet.

Um gleichzeitig menschliches Albumin und menschliche Zellkerne nachzuweisen, wurden Gewebeobjektträger einer Antigengewinnung unterzogen (Citrat-basierter Puffer, pH 6,0), gefolgt von einer IHC-Färbung mit dem ImPRESS® Duet Double Staining Polymer Kit (Vector Laboratories, MP-7714), einschließlich der Blockierung mit BLOXALL Blockierungslösung und normales Pferdeserum (2,5 %) gemäß Herstellerangaben. Die beiden verwendeten Primärantikörper waren ein Maus-Anti-Human-Albumin-Antikörper (ThermoFisher, MA1-19174) und ein Kaninchen-Anti-Human-Ku80-Antikörper (Cell Signaling Technology, 2753S), verdünnt im Verhältnis 1:200 bzw. 1:100 in MAXBind -Färbelösung (Active Motif, 15253) und über Nacht bei 4 °C gemäß Herstellerangaben inkubiert. Als Sekundärantikörper wurden ein an AP konjugierter Anti-Maus-IgG-Antikörper und ein an HRP konjugierter Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Vector Laboratories, MP-7714) als gebrauchsfertige Lösung verwendet, die 10 Minuten bei RT inkubiert wurde. Nach dem Waschen wurde ImmPACT DAB-Substrat hinzugefügt und man ließ es 2 Minuten lang bei RT entwickeln. Die Objektträger wurden gewaschen, ImmPACT Vector Red-Substrat hinzugefügt und 4 Minuten lang bei RT entwickeln gelassen. Die Objektträger wurden mit Wasser gespült und anschließend eine Hämatoxylin-Gegenfärbung aufgetragen.

Positive Gewebekontrollen (menschliche Gewebe) und negative Gewebekontrollen (Nicht-IUTx-Schafgewebe) wurden parallel zu jedem durchgeführten Experiment gefärbt und ausgewertet, wobei experimentelle Gewebeobjektträger ausgewertet wurden. Einzelheiten zu den verwendeten Antikörpern, Verdünnungen und Validierungsmethoden finden Sie in der Ergänzungstabelle 7. Gewebeschnitte wurden mit einem LEICA DM4000B-Hellfeldmikroskop (20-fache Vergrößerung) abgebildet und positive Zellen durch Bild J identifiziert/quantifiziert.

Die reaktiven Gedächtnis-Th1- und Th2-Reaktionen auf ET3 wurden durch IFN-γ- (MabTech, 3119-4APW-2) und IL-4- (MabTech, 3118-2 A) ELISpot-Assays wie zuvor beschrieben53,54 bestimmt. PBMC wurden aus Vollblut unter Verwendung von Histopaque 1077 (Sigma Aldrich, 1077) gemäß den Richtlinien des Herstellers isoliert. PBMCs wurden dann unter einer von drei Bedingungen kultiviert: ohne stimulierendes Antigen (keine Stimuluskontrolle), mit ET3 oder in Gegenwart des unspezifischen Mitogens Phytohämagglutinin-L (PHA-L) (Sigma Aldrich, C11249738001), auf das getestet werden sollte Zellanergie. Die Arbeitskonzentrationen von ET3 und PHA-L betrugen 10 μg/ml. Nach Abschluss der 40-stündigen Co-Kultur wurde die Platte gewaschen und Anti-Schaf-IFN-γ und IL-4 hinzugefügt, gefolgt von einem an ALP konjugierten sekundären Antikörper und der Visualisierung von Flecken durch enzymatische Spaltung des ALP-Substrats. Eine positive Reaktion wurde definiert, wenn beide der folgenden Kriterien erfüllt waren: (1) das Verhältnis zwischen der Anzahl der spotbildenden Einheiten (SFU) in Anwesenheit und Abwesenheit von ET3 ist > 2 (Stimulationsindex >2); und (2) ein Schwellenwert von mindestens 10 SFU/2 × 105 PBMC wurde erreicht.

Um festzustellen, ob IUTx-Empfänger gegenüber Spender-PLC tolerant waren, testeten wir proliferative Reaktionen mittels gemischter Lymphozytenreaktion (MLR) unter Verwendung eines 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU)-ELISA (Roche, 12352200). Ein MLR bietet ein effizientes und hochspezifisches In-vitro-Modell für die Untersuchung der T-Zell-Proliferation als Reaktion auf allogenes oder xenogenes Antigen. Für diese Tests wurden die Responderzellen aus PBMC isoliert, die aus IUTx-Empfängern und Nicht-IUTx-Kontrolltieren isoliert wurden. Stimulatorzellen waren: (1) nicht transduzierte PLC vom gleichen Spender; (2) PLC desselben Spenders, transduziert mit LV-Vektor, der mcoET3 kodiert; (3) xenogene (humane) PBMC und (4) PHA-L als stimulierendes Mitogen. Responderzellen wurden auch einzeln kultiviert, um die Grundwerte des BrdU-Einbaus während der Inkubationszeit zu bestimmen. Nach der Aussaat von 96-Well-Platten mit den Stimulatorzelltypen 1 bis 3 in dreifacher Ausfertigung wurde durch Zugabe von Mitomycin C (Stem Cell Technologies, 73274) ein Zellzyklusstopp (nur in den Stimulatorzellen) induziert. Die Konzentration von Mitomycin C, die erforderlich ist, um die Zellteilung bei PLC gezielt zu stoppen, wurde empirisch ermittelt, wobei Mitomycin C-Konzentrationen im Bereich von 0,5 bis 50 ng/ml getestet wurden. Nach gründlichem Waschen der Stimulatorzellen wurden Responder-PBMC hinzugefügt und im Verhältnis 10:1 (Responder:Stimulator) co-kultiviert. Die MLR-Kokultur erfolgte 120 Stunden lang in IMDM 10 % FBS, dann wurden die Zellen über Nacht mit dem Thymidin-Analogon BrdU markiert und mittels ELISA gemäß den Richtlinien des Herstellers auf unterschiedliche Absorption getestet. Der Stimulationsindex (SI) wurde auf der Grundlage typischer SI-Kriterien für MLR-Kulturen berechnet, wobei: SI = (Stimulator + Responder) / (Responder).

Um festzustellen, ob IUTx-Empfänger aufgrund der Exposition gegenüber menschlichem PLC eine HLA-gerichtete Antikörperreaktion entwickelten, wurde ein Luminex-Assay zum Nachweis von HLA-IgG-Antikörpern der Klassen I und II gemäß den Herstellerangaben durchgeführt (Immucor, 628200). Kurz gesagt, 1,2 μm Multiscreen-Filterplatten (Millipore Sigma, MSBVN1210) wurden verwendet, um die vom Hersteller bereitgestellte HLA-Perlenmischung zusammen mit Serum von IUTx-Empfängern im angegebenen Verhältnis zu inkubieren. Nach 30-minütiger Inkubation wurden die Plattenvertiefungen dreimal gewaschen (Waschpuffer: Puffer auf Phosphatbasis mit NaCl, Tween-20, NaN3 und BSA). Dann wurde ein Schaf-IgG-Phycoerythrin-Antikörper-Konjugat (R&D Systems, F0126) für eine zusätzliche 30-minütige Inkubation in Waschpuffer gegeben. Anschließend wurde das vorgeschriebene Volumen an Waschpuffer hinzugefügt, gemischt, um die Perlen zu resuspendieren, die Fluoreszenz der Probe wurde mit einem Luminex 200 Fluoroanalyzer bestimmt und die Analyse wurde mit der Luminex-Antikörpersoftware durchgeführt. Der mittlere Fluoreszenzintensitätswert (MFI) jeder Perle wurde mit drei Grenzwerten verglichen, um Hintergrundanpassungsfaktoren (BAFs) festzulegen. Die Grenzwerte wurden aus dem ermittelten Hintergrund von drei Negativkontrollkügelchen in jeder Testvertiefung berechnet. Dies wurde für jede der beiden Perlen wiederholt, um drei Ergebnisse oder angepasste MFI-Werte (AMFI) zu erhalten. Eine Probe galt als positiv, wenn zwei oder mehr AMFI-Werte positiv waren. Eine Probe galt als negativ, wenn zwei oder mehr AMFI-Werte negativ waren.

Ein spezialisierter Veterinärpathologe führte eine makroskopische anatomische Untersuchung durch, um das Vorhandensein therapiebedingter morphologischer Anomalien festzustellen, und wertete mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbte Schnitte von Leber, Lunge, Milz, Thymus, Darm und Gehirn aus, um mögliche histopathologische Veränderungen zu identifizieren.

Wir haben zuvor die Etablierung einer Linie von HA-Schafen beschrieben, die eine vorzeitige Stoppcodon- und Frame-Shift-Mutation im Exon 14 des FVIII-Gens aufweisen. Klinisch ähneln diese Tiere stark der schweren menschlichen HA und weisen durchweg einen schweren Blutungsphänotyp mit spontaner Hämarthrose auf, die zu verminderter Fortbewegung, Muskelhämatomen und Hämaturie-Episoden führt. Wenn diese HA-Schafe außerdem nicht kurz nach der Geburt behandelt werden, sterben die Tiere an inneren oder Nabelschnurblutungen. Um HA-Tiere zu erzeugen, wurden HA-Träger durch natürliche Züchtung oder durch Klonen mittels somatischem Zellkerntransfer gezüchtet.

Alle angezeigten Daten werden, sofern nicht anders angegeben, als Mittelwert +/− Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Zur Durchführung aller statistischen Analysen wurde die Software GraphPad PRISM v8 verwendet. Vergleiche zwischen experimentellen Ergebnissen wurden entweder durch den zweiseitigen Student-t-Test für einzelne Vergleiche oder durch eine einfaktorielle ANOVA gefolgt von einer Post-hoc-Analyse unter Verwendung der Tukey-Methode für Daten mit mehreren Vergleichen ermittelt, um einzelne p-Werte zu bestimmen. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Der Nachweis spezifischer Zellmarker und die Quantifizierung menschlicher Ku80 (Kernantigen)-positiver Zellen in der Leber von IUTx-Tieren durch Immunhistochemie unter Verwendung eines chromogenen Nachweises wurden in Objektträgern aller Tiere sowie von positiven (menschlichen) und negativen (unbehandelten Schafen) Kontrollen durchgeführt in mindestens drei verschiedenen Experimenten. Auf jedem Objektträger wurde die Quantifizierung in drei Regionen von Interesse (ROI) durchgeführt. Um Beobachterverzerrungen zu vermeiden, wurde ein ImageJ-Skript verwendet, um den ROI (ROIs) zu verarbeiten und positive Zellen zu identifizieren. Das Skript entfaltete jedes ROI-Bild in ein H&E-Bild und ein DAB-Bild und berücksichtigte dann positive Zellen anhand von Größe, Zirkularität und Farbschwellenwert. Im Detail wurden spezielle Makros mit mehreren Funktionen erstellt, um eine Reihe von Aufgaben zu automatisieren, darunter die Normalisierung, Verarbeitung und Analyse einer großen Anzahl von Bildern. Im Normalisierungsschritt wurden Techniken wie die Farbentfaltung verwendet, die Bildkanäle in bis zu drei spezifische Farben aufteilt. Es wurden auch Aufgaben wie Schärfung und Kontrastnivellierung verwendet, um Intuition für die nachgelagerte Analyse zu gewinnen. Außerdem wurde eine „Hintergrund subtrahieren“-Funktion zum Isolieren und Analysieren von Merkmalen in einem Bild über einer gleichmäßigen Hintergrundintensität sowie die „Nachher“-Funktion mit automatischen Schwellenwertalgorithmen angewendet, um das Bild basierend auf Pixelintensitätswerten in verschiedene Bereiche zu segmentieren. Die Funktion „Wasserscheide“ wurde verwendet, um sich berührende oder überlappende Objekte im Bild zu trennen. Nach der Normalisierung jedes Bildes wurde die Funktion „Partikel analysieren“ verwendet, um Merkmale im Bild zu identifizieren und zu messen, wobei Optionen für Größenbereich, Form und Identität basierend auf der Visualisierung des positiven Signals ausgewählt wurden. In einigen Fällen war eine weitere Feinabstimmung der Analyseparameter erforderlich, um genaue Ergebnisse zu erhalten, was durch „Training“ jedes Datensatzes erfolgte. Das Makro wurde mehrmals ausgeführt, wobei die Parameter nach Bedarf angepasst wurden, um die Gesamtleistung zu verbessern. Leider waren keine Ground-Truth-Daten verfügbar, daher wurden die Parameter nach einer visuellen Prüfung der Ergebnisse des Makros manuell angepasst, um die Genauigkeit sicherzustellen.

Der Nachweis menschlicher Ku80- (Kernantigen) und FVIII-positiver Zellen durch Immunhistochemie unter Verwendung von Immunfluoreszenz wurde bei IUTx-Tieren sowie bei positiven (menschlichen) und negativen (unbehandelten Schafen) Kontrollen in mindestens drei verschiedenen Experimenten durchgeführt. Die Quantifizierung erfolgte mit drei verschiedenen Objektträgern und einer Zählung von insgesamt 1000–1500 Zellen.

Für die histopathologische Analyse (Abb. 8) wurden, wann immer die entnommene Gewebemenge es erlaubte, 2–4 Gewebeschnitte pro Organ eingesandt und vom Pathologen analysiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die wichtigsten Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier sowie in den Zusatzinformationen und Zusatzdatendateien verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Die in dieser Studie generierten Sequenzierungsdaten der nächsten Generation wurden bei GEO unter der Zugangsnummer GSE230081 hinterlegt. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Die benutzerdefinierten Skripte zur Quantifizierung positiver Zellen mithilfe von ImageJ sind auf GitHub verfügbar: https://github.com/jhd8593/Martin_IHC.git

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Diese Arbeit wurde von NIH, NHLBI, HL135853, HL148681 unterstützt. MR und GDA sind die Empfänger eines Fellow/Mentor-Stipendiums der HHMI Gilliam Graduate Fellowships. BT wird von einer T32-Vordoktorandenstelle NIH NIBIB 2T32EB014836-06A unterstützt. Der Mick Hitchcock Ph.D. Das Nevada Proteomics Center wird von NIH, NIGMS, GM103440 unterstützt. Wir danken dem Wake Forest Baptist Health Special Hematology Laboratory für die hervorragende technische Unterstützung und die Durchführung der FVIII-Tests, dem Wake Forest Institute for Regenerative Medicine Translational Core Manufacturing Center für die Bereitstellung der in diesen Studien verwendeten PLC und Wake Forest ARP für die Klinik Pflege der Tiere, und Rebecca Woolsey am Mick Hitchcock Ph.D. Nevada Proteomics Center. Wir möchten Dr. Samuel Rulli und Dr. Martin Kreutz von Qiagen für ihre Hilfe bei der experimentellen Gestaltung der Zelldifferenzierungsbewertung sowie für die Durchführung der RNA-seq-Bibliothekskonstruktion, NGS und Datenanalyse danken.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Christopher D. Porada, Graça Almeida-Porada.

Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Fetal Research and Therapy Program, Wake Forest School of Medicine (WFSOM), Winston Salem, NC, USA

Martin Rodriguez, Brady Trevisan, Ritu M. Ramamurthy, Sunil K. George, Jonathan Diaz, Anthony Atala, Christopher D. Porada und Graça Almeida-Porada

Aflac Cancer and Blood Disorders Center, Children's Healthcare of Atlanta und Abteilung für Pädiatrie, Emory University, Atlanta, GA, USA

Jordan Alexander, Christopher B. Doering und H. Trent Spencer

Spezielles Hämatologielabor, Wake Forest School of Medicine, Winston Salem, NC, USA

Diane Meares und Andrew Farland

Präklinische Entwicklung, Wave Life Sciences, Lexington, MA, USA

Denise J. Schwahn

Der Mick Hitchcock Ph.D. Nevada Proteomics Center, University of Nevada Reno, Reno, NV, USA

David R. Quilici

Zentrum für Forschung in Geburtshilfe und Gynäkologie, WFSOM, Winston Salem, NC, USA

Jorge Figueroa

HLA/Immunogenetics and Immunodiagnostics Laboratories, Winston Salem, NC, USA

Michael Gautreaux

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MR, BT, RR und SKG führten Experimente, Datenanalysen und Interpretationen durch; JD, DM, DRQ, AF, MG, JF und DS stellten technisches Fachwissen zur Verfügung; JA stellte Reagenzien zur Verfügung; CBD, HTS und AA lieferten Reagenzien und experimentelles Feedback; MR verfasstes Manuskript; GAP- und CDP-Konzeption und experimentelles Design, überwachte Experimente, führte Datenanalyse und -interpretation durch, verfasste die endgültige Version des Manuskripts und sicherte die Finanzierung.

Korrespondenz mit Graça Almeida-Porada.

CBD und HTS sind Mitbegründer von Expression Therapeutics, Inc. und besitzen Anteile am Unternehmen. Dr. Denning ist ein Mitarbeiter von Expression Therapeutics, Inc. Expression Therapeutics hat das geistige Eigentum im Zusammenhang mit dem codonoptimierten ET3-Transgen und dem HCB-Promotor lizenziert. Die Bedingungen dieser Vereinbarung wurden von der Emory University in Übereinstimmung mit ihren Richtlinien zu Interessenkonflikten überprüft und genehmigt. Die übrigen Co-Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen und nichtfinanziellen Interessen.

Nature Communications dankt Diana Lee Farmer, Alan Flake und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Rodriguez, M., Trevisan, B., Ramamurthy, RM et al. Die Transplantation von FVIII/ET3-sezernierenden Zellen in fötale Schafe erhöht den FVIII-Spiegel langfristig, ohne Immunität oder Toxizität auszulösen. Nat Commun 14, 4206 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39986-1

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Eingegangen: 19. April 2022

Angenommen: 26. Juni 2023

Veröffentlicht: 14. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39986-1

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