Bacteroides ovatus beschleunigt Metformin

npj Biofilms and Microbiomes Band 9, Artikelnummer: 51 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Ein Mangel an Vitamin B12 (VB12), der zu hämatologischen und neurologischen Symptomen führen kann, wurde mit der Einnahme von Metformin in Verbindung gebracht, der zugrunde liegende Mechanismus ist jedoch unklar. Hier berichten wir über B. ovatus als wirksamen VB12-Fänger, der bei Patienten mit Typ-2-Diabetes, die nach 3 bis 6 Monaten Metformin-Behandlung an einem VB12-Mangel litten, angereichert wurde. Die Kolonisierung von B. ovatus erhöhte die Plasmaspiegel von Methylmalonsäure und Homocystein bei Mäusen, die mit fettreicher Diät (HFD) gefüttert und mit Metformin behandelt wurden, und beeinträchtigte die Wirksamkeit von Metformin gegen die HFD-induzierten Stoffwechselstörungen. Mechanistisch gesehen erhöhte Metformin die intrazelluläre Akkumulation von VB12 in B. ovatus über die Hochregulierung von btuB und förderte die ATP-Produktion für die energieabhängige Translokation von VB12-Transportern an der Innenmembran, was zu einer verstärkten Kolonisierung von B. ovatus führte, um mit Wirten und anschließend um VB12 zu konkurrieren ein verschlimmerter VB12-Mangel im Wirt. Unsere Ergebnisse veranschaulichen einen bisher unbeachteten Mechanismus von Metformin, der zu einem VB12-Mangel im Wirt führt, indem es direkt auf Darmbakterien einwirkt, um deren VB12-Aufnahme und -Verbrauch zu erhöhen, und legen nahe, dass die Konkurrenz zwischen Wirten und Mikroben um Nährstoffe weitreichende Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und die Arzneimittelsicherheit haben kann.

Metformin ist die blutzuckersenkende Erstlinientherapie für Patienten mit Typ-2-Diabetes und wird von allen Leitlinien anerkannt1. Die in der Packungsbeilage aufgeführte Hauptnebenwirkung ist ein erhöhtes Auftreten von Vitamin B12 (VB12)-Mangel (zwischen 5,8 % und 33 %)2, was positiv mit der Dosierung und Dauer der Metformin-Behandlung zusammenhängt.

VB12 (Cobalamin), das aus Lebensmitteln tierischen Ursprungs gewonnen wird, dient als essentieller Cofaktor bei der DNA-Synthese sowie dem Fettsäure- und Aminosäurestoffwechsel. Zu den klinischen Manifestationen eines VB12-Mangels gehören Anämie, periphere Neuropathie, kognitive Beeinträchtigung und Depression2,3. Insbesondere die diabetische periphere Neuropathie (DPN), die Nerven außerhalb des Gehirns und des Rückenmarks schädigt und das Risiko für die Entwicklung eines Charcot-Fußes erhöht, ist eine der häufigsten und schwerwiegendsten Komplikationen von Diabetes4. Allerdings wird ein Metformin-assoziierter VB12-Mangel normalerweise als wichtige Ursache der Neuropathie ignoriert. Darüber hinaus können Blässe und psychische Symptome wie Müdigkeit und Gedächtnisverlust vor einer offenen Anämie auftreten. Daher wird ein VB12-Mangel bei Diabetikern in der Regel unterdiagnostiziert, bis schwerwiegendere klinische Probleme (z. B. irreversible Neuropathie und Demenz) auftreten, insbesondere bei älteren Personen5. Eine groß angelegte Studie (n = 1975) zeigte, dass im Vergleich zu Typ-2-Diabetes-Patienten, die andere Antidiabetika erhielten, diejenigen, die eine Metformin-Therapie erhielten, eine höhere Prävalenz von DPN aufwiesen, was signifikant mit höheren kumulativen Dosen und einer längeren Dauer der Metformin-Behandlung verbunden war , was darauf hinweist, dass der Sicherheit einer Langzeitbehandlung mit Metformin mehr Aufmerksamkeit gewidmet werden sollte6. Allerdings wurde der Metformin-assoziierte VB12-Mangel in den letzten Jahren nicht ausreichend erkannt und die genaue Ursache ist immer noch nicht bekannt. Daher ist das Verständnis des Zusammenhangs zwischen der Einnahme von Metformin und dem VB12-Status klinisch bedeutsam, da es die Wirksamkeit von Metformin verbessern und dazu beitragen könnte, seine Nebenwirkungen bei Patienten mit Typ-2-Diabetes zu verhindern.

Es wurde vermutet, dass Metformin die Ca2+-abhängige Bindung des VB12-Intrinsic-Faktor-(IF)-Komplexes hemmt, was die Absorption von VB12 im terminalen Ileum beeinträchtigt7,8. Es bleibt jedoch unklar, warum der Metformin-assoziierte VB12-Mangel durch eine hohe Heterogenität gekennzeichnet ist, wie aus einem Bericht einer früheren Metaanalyse2 hervorgeht. Obwohl eine erhöhte Kalziumaufnahme dazu beitragen könnte, die durch Metformin induzierte Holotranscobalamin-Reduktion umzukehren, stieg der Gesamt-VB12-Spiegel im Serum nach einem Monat Kalziumkarbonat-Supplementierung nicht effektiv an8. Zusammengenommen zeigt dies, dass der Mechanismus, durch den Metformin die Serumkonzentrationen von VB12 senkt, unklar bleibt.

Es wurde berichtet, dass nur 20 % der Bakterien- und Archaealarten, wie etwa Propionibacterium UF19, in der Lage sind, Cobalamin über vollständige De-novo-Biosynthesewege zu synthetisieren. 12. Aufgrund der weit verbreiteten Auxotrophie sind Mikroben auf VB12-produzierende Mitglieder angewiesen, um ihre Funktion aufrechtzuerhalten. Daher stellen die Darmmikroben ein zweischneidiges Schwert dar und stellen nicht nur VB12 für den Wirtsmenschen durch Fermentation komplexer Kohlenhydrate bereit, sondern konkurrieren auch mit dem Menschen um VB12. Eine übermäßige Anzahl von Bakterien, die den Dünndarm besiedeln, könnte zu einer Überwucherung von Dünndarmbakterien (SIBO) führen, die aufgrund der langsamen Dünndarmpassage und der erhöhten Aufnahme der vom Menschen benötigten Vitamine und Nährstoffe mit dem Risiko von Typ-2-Diabetes13 verbunden ist. Allerdings haben nur wenige Studien einen spezifischen Zusammenhang zwischen den Darmmikroben und einem Metformin-induzierten VB12-Mangel untersucht.

Daher bestand das Hauptziel der vorliegenden Studie darin, Zusammenhänge zwischen Darmmikrobiota und VB12-Status bei Patienten mit Diabetes unter Metformin zu untersuchen. Wir stellten die Hypothese auf, dass einige spezielle Stämme mithilfe von Metformin VB12 aus dem Magen-Darm-Trakt entführen könnten. Da wir die Veränderungen der bakteriellen Elektronentransportketten unter Metformin analysiert haben, bestand das sekundäre Ziel unserer Studie darin, mögliche Mechanismen zu untersuchen, durch die das Antidiabetikum Metformin direkt auf Bakterien einwirkt, um das Profil der Darmmikrobiota zu modulieren. Wir berichten anhand von Daten aus einer prospektiven Patientenkohorte, die Probanden mit neu diagnostiziertem Typ-2-Diabetes umfasste, die 3 bis 6 Monate lang mit Metformin behandelt wurden, dass die relative Häufigkeit von Bacteroides ovatus im Darm mit einem Metformin-induzierten Vitamin-B12-Mangel verbunden war. Wir fanden heraus, dass die Behandlung mit Metformin die Expression des mikrobiellen btuB-Gens hochregulierte und die Adenosintriphosphat (ATP)-Produktion in B. ovatus regulierte, was seine Fähigkeit zum Einfangen von VB12 stärkte und anschließend die Serumspiegel von VB12 im Wirt senkte.

Es wurde berichtet, dass es nach einer 6-wöchigen Metformin-Therapie zu einer statistisch signifikanten Verringerung der VB12-Spiegel kam14. Hierin haben wir eine prospektive klinische Studie entworfen, die eine 12 bis 24-wöchige Metformin-Behandlung bei neu diagnostizierten Typ-2-Diabetes-Patienten umfasst. Gemäß den etablierten Kriterien15 beurteilten wir den VB12-Status und die klinischen Manifestationen eines VB12-Mangels bei 26 Patienten, die in VB12-Mangel (n = 13, Gesamt-VB12 im Serum < 200 pg/ml) und nicht-Mangel (n = 13, Serumgesamt-VB12 > 200 pg/ml) Gruppen. Ihre klinischen Merkmale sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Die Patienten mit Mangel hatten im Vergleich zu Patienten ohne Mangel einen signifikant niedrigeren Gesamt-VB12-Serumspiegel und einen höheren Homocysteinspiegel, jedoch keine signifikanten Unterschiede bei Folsäure und Hämoglobin (Abb. 1a– D).

a Gesamt-VB12-Serumspiegel von Typ-2-Diabetes-Patienten nach 12–24-wöchiger Metformin-Behandlung. b Die Homocysteinwerte von Typ-2-Diabetes-Patienten nach Metformin-Behandlung. c Die Folatspiegel von Typ-2-Diabetes-Patienten nach Metformin-Behandlung. d Die Hämoglobinwerte von Typ-2-Diabetes-Patienten nach Metformin-Behandlung. e Gestapelte Balkendiagramme, die die durchschnittliche prozentuale relative Häufigkeit auf Gattungsebene für Mangel- bzw. Nicht-Mangelgruppen zeigen. Die am häufigsten vorkommenden Taxa werden als verschiedenfarbige Balken angezeigt, während Taxa mit geringerer Häufigkeit als grauer Balken gruppiert werden (Andere). f Unterschiede in der bakteriellen Taxonomie wurden gemäß der Effektgröße der linearen Diskriminanzanalyse (LDA) zwischen Mangel- und Nicht-Mangel-Gruppen eingestuft. g Spearmans Korrelation zwischen Bakterienhäufigkeit und VB12-Status-Biomarkern. h Häufigkeit von B. ovatus, P. vulgatus und B. uniformis basierend auf Metagenomikdaten. Die statistische Signifikanz basiert auf P-Werten und q-Werten, die aus der MaAsLin2-Analyse ermittelt wurden. i Vulkandiagramm des ALDEx2-Differentialhäufigkeitstests an Arten in Stuhlmikrobiota von Personen mit und ohne Mangel, wobei deutlich unterschiedliche Arten hervorgehoben wurden (FDR < 0,05). j Variable Importance in Projection (VIP) eines zufälligen Waldklassifikators, der unter Verwendung taxonomiebezogener Daten entwickelt wurde. k PCoA der Häufigkeit von KEGG-Orthologen (KOs); Die Mangelgruppe wird in Blau dargestellt, die Nicht-Mangelgruppe in Rot; Der PERMANOVA-Test mit der Bray-Curtis-Distanz wurde verwendet, um den signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen zu bewerten, und das Ergebnis zeigte eine signifikante Trennung der Mangel- und Nicht-Mangel-Gruppen (P = 0,002). l Vulkandiagramm der metagenomischen Sequenzierungsdaten basierend auf dem KEGG-Ortholog (KOs) in den Mangel- und Nicht-Mangel-Gruppen. P-Wert, bestimmt durch den zweiseitigen ungepaarten Student-t-Test (b, d) und den Mann-Whitney-U-Test (a, c, g). Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM oder Mittelwert ± SD dargestellt.

Um zu untersuchen, ob sich die Darmmikrobiota zwischen der defizienten und der nicht defizienten Gruppe unterscheidet, führten wir zunächst eine Shotgun-Sequenzierung des gesamten Genoms durch, um die taxonomische Identifizierung des Mikrobioms über MetaPhlAn 4.0.6 zu untersuchen. Die Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) ergab, dass das Profil der Darmmikrobiota eine deutliche Veränderung zwischen den beiden Gruppen aufwies (ergänzende Abbildung 1a). Bei Patienten mit VB12-Mangel war die relative Häufigkeit von Bacteroidetes hochreguliert, während die relative Häufigkeit von Firmicutes auf Stammebene herunterreguliert war. Auf Gattungsebene wurden die relativen Häufigkeiten von Megamonas spp., Bifidobacterium spp. und Blautia spp. verringert, während die Häufigkeit von Bacterioides spp., Phocaeicoia spp. und Roseburia spp. wurden verbessert (Ergänzende Abbildung 1b, c). In Übereinstimmung mit der Artenebene (Abb. 1e) ergab die Analyse mit der Methode der linearen Diskriminanzanalyse (LDA) der Effektgröße (LEfSe), dass die Mangelgruppe durch B. ovatus, B. uniformis und Phocaeicola vulgatus gekennzeichnet war (Abb. 1f). . Und der Reichtum an B. ovatus und P. vulgatus korrelierte negativ mit dem VB12-Spiegel (Abb. 1g). Differentialanalysen wurden unter Verwendung des MaAsLin2-, ALDEx2- und Wilcoxon-Rangsummentests mit Anpassung an Kovariaten durchgeführt. Wir fanden heraus, dass B. ovatus in der Mangelgruppe eine signifikant höhere Häufigkeit aufwies (Abb. 1h, i; ergänzende Abb. 1d). Als nächstes verwendeten wir einen zufälligen Waldklassifikator, um die Unterscheidungsmerkmale in der Darmmikrobiota für die Unterscheidung von Arten wie B. ovatus und P. vulgatus auszuwählen (Abb. 1j).

Die funktionellen Genprofile der Darmmikrobiota auf KO-Ebene unterschieden sich ebenfalls zwischen den beiden Gruppen (Abb. 1k). TonB-abhängige Transporter (TBDTs) in der Außenmembran (OM) gramnegativer Bakterien binden und transportieren VB12 aus der Umgebung über das OM in den periplasmatischen Raum16,17. Das TonB-Gen, das das TonB-Protein kodiert, war in der defizienten Gruppe angereichert. Im Gegensatz dazu war die Expression von mtsA, mtsB und mtsC, die für substratbindende Proteine ​​des Eisen-/Zink-/Mangan-/Kupfer-Transportsystems kodieren, in der defizienten Gruppe relativ gering (Abb. 1l). Bacteroides spp. Biosynthese B12-abhängiger Enzyme. Es wurde berichtet, dass P. vulgatus VB12-Biosynthesegene (wie CbiA, CbiC) kodieren könnte18, nicht jedoch B. ovatus, der VB12 aus dem Verdauungstrakt einfangen muss19. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Fähigkeit zur VB12-Aufnahme durch bestimmte Darmmikroben, wie beispielsweise angereichertes B. ovatus, unter der Behandlung mit Metformin erhöht sein könnte.

Wir untersuchten die Wirkung der Metformin-Behandlung auf die Akkumulation von VB12 in B. ovatus. Die Konzentration von VB12 im Bakterienpellet wurde mittels LC-MS/MS bestimmt (Ergänzende Abbildung 2a – e). Das aktuelle Wissen über TBDTs in Bakterien ist begrenzt, mit Ausnahme von Escherichia coli20. Als Kontrolle verwendeten wir E. coli K12, das offenbar einen hohen Anteil an VB12 aus dem Wachstumsmedium aufnimmt. Während keine signifikante Veränderung in den Wachstumskurven von E. coli festgestellt wurde, die mit verschiedenen Metforminkonzentrationen behandelt wurden (Abb. 2a), förderte die Metforminbehandlung dosisabhängig das Wachstum von B. ovatus in der stationären Phase, indem sie seine Anpassungsfähigkeit förderte (Abb. 2b). Anschließend untersuchten wir die Wirkung der Metformin-Behandlung auf die intrazelluläre VB12-Konzentration für die beiden Stämme, die in mit Cyanocobalamin ergänzten Minimalmedien wuchsen. Wir haben eine Konzentration von 3,7 nM für Cyanocobalamin19 gewählt, da es die mit B12-Riboschaltern verbundenen RNA-Elemente, die bei spezifischer Bindung an VB12 ihre Konformation ändern können, nicht unterdrücken kann. Bemerkenswerterweise erhöhte Metformin die intrazelluläre Akkumulation von VB12 sowohl in E. coli als auch in B. ovatus signifikant (Abb. 2c, d).

a, b Wachstumskurven von E. coli oder B. ovatus mit Metformin in unterschiedlichen Konzentrationen (3 technische Replikate von 6 biologischen Replikaten für jede Gruppe). c, d VB12-Konzentrationen in E. coli oder B. ovatus mit Metformin in unterschiedlichen Konzentrationen (n = 9). e–g Relative mRNA-Häufigkeiten von TonB, metH und scpA in E. coli, die 1 Stunde lang mit Metformin behandelt wurden (n = 5). h–j Relative mRNA-Häufigkeiten von btuB, metH und scpA in B. ovatus, behandelt mit Metformin für 7 Stunden (n = 5). P-Wert bestimmt durch den Kruskal-Wallis-Test (b, e–h, i) und die einfaktorielle ANOVA mit Tukey- oder Dunnett-Test (c, d, f, g, j). Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM oder Mittelwert ± SD dargestellt.

TBDTs bestehen aus TonB, ExbB und ExbD, die durch den elektrochemischen Gradienten angeregt werden17. Die Corrinoid-Transportorte sowohl in E. coli als auch in Bacteroides spp. verfügen über einen OM-Transporter (BtuB), um VB12 aus der Umgebung einzufangen, und dann über ein periplasmatisches Bindungsprotein (BtuF) und ATP-abhängige Transporter der inneren Membran (IM) (BtuC und BtuD), um VB12 vom Periplasma zum Zytoplasma zu übertragen21. In Übereinstimmung mit seiner Wirkung auf die intrazellulären VB12-Konzentrationen regulierte Metformin (1,5 mM) die Expression von TonB in E. coli in vitro signifikant (Abb. 2e), es wurden jedoch keine signifikanten Veränderungen für die Expression von Genen gefunden, die für andere TBDTs oder Bindungsproteine ​​kodieren ( Ergänzende Abbildung 3a). Der mRNA-Spiegel von btuB in B. ovatus war nach 7-stündiger Metformin-Inkubation (40 μM, 1,5 mM) viel höher (Abb. 2h). Aufgrund der translatorischen Riboswitch-Kontrolle der btuB-Expression am 5′-Ende16 vermuteten wir, dass die Expression von btuB möglicherweise nach der allmählichen intrazellulären Akkumulation von VB12 gehemmt wird. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese stellten wir fest, dass die Expression von btuB nach 12 Stunden dosisabhängig anzusteigen schien (ergänzende Abbildung 3b), gefolgt von einem abrupten Rückgang 24 Stunden nach der Metformin-Behandlung (ergänzende Abbildung 3e).

Vitamin B12 (Cobalamin) dient als Cofaktor für MetH und scpA, die die Bildung von Methionin über die Übertragung einer Methylgruppe von 5-Methyltetrahydrofolat auf Homocystein bzw. die Isomerisierung von Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA katalysieren. Um zu testen, ob VB12 über OM und IM in das Zytoplasma transportiert wurde, wählten wir die Expression von metH und scpA als Biosensoren, um den intrazellulären Spiegel an verfügbarem VB1217 darzustellen. Interessanterweise stimmten die mRNA-Spiegel von metH und scpA in B. ovatus mit denen von btuB überein (Abb. 2i, j, ergänzende Abb. 3c, d, ergänzende Abb. 3f, g), was implizierte, dass die Behandlung mit Metformin die Leistungsfähigkeit von erhöhte B. ovatus konkurriert um VB12. Allerdings wurden in E. coli, die mit 40 μM Metformin behandelt wurden, nur mäßige Expressionsänderungen in metH und scpA gefunden, nicht jedoch in denen, die mit 1,5 mM behandelt wurden (Abb. 2f, g). Diese Daten deuteten darauf hin, dass Metformin die mikrobielle VB12-Aufnahme steigern könnte. Allerdings kann nicht jedes VB12 von verschiedenen Bakterien effektiv genutzt werden.

Wir führten eine bakterielle RNA-Sequenzierung durch, um die biologischen Prozesse zu identifizieren, die durch die Metformin-Behandlung beeinflusst wurden. Das Vulkandiagramm hebt die unterschiedlich exprimierten Gene von E. coli (49 Gene wurden hochreguliert; 48 Gene wurden herunterreguliert) und B. ovatus (46 Gene wurden hochreguliert; 34 Gene wurden herunterreguliert) nach der Metformin-Behandlung hervor (Abb. 3a, b).

ein Vulkandiagramm, das die unterschiedliche Expression der 97 Gene von E. coli zeigt, die mit Metformin (bei 1,5 mM) im Vergleich zur Kontrolle behandelt wurden. Die blauen Punkte stellen Gene dar, die deutlich herunterreguliert sind, und rote Punkte stellen Gene dar, die hochreguliert sind (n = 3). b Vulkandiagramm, das die unterschiedliche Expression der 80 Gene von B. ovatus, behandelt mit 1,5 mM Metformin, im Vergleich zur Kontrolle zeigt. Die blauen Punkte stellen Gene dar, die deutlich herunterreguliert sind, und rote Punkte stellen Gene dar, die hochreguliert sind (n = 3). c Relative mRNA-Häufigkeiten von fdnH in E. coli, behandelt mit Metformin für 1 Stunde (n = 3). d Die ATP-Konzentrationen in E. coli, die 1 Stunde lang mit Metformin behandelt wurden (n = 5). e Das Membranpotential von E. coli, behandelt mit Metformin für 1 Stunde (n = 5). f Das NADH/NAD+-Verhältnis von E. coli, behandelt mit Metformin und/oder terminalem Elektronenakzeptor (DMSO, NaNO2 und TMAO) für 1 Stunde (n = 3). g Relative mRNA-Expression kodierender Enzyme, die an ATP-Synthase-Genen beteiligt sind, in B. ovatus, behandelt mit Metformin für 7 Stunden (n = 3). h Die ATP-Konzentrationen in B. ovatus, die 7 Stunden lang mit Metformin behandelt wurden (n = 3). i Die ATP-Konzentrationen in B. ovatus, behandelt mit 1,5 mM Metformin für 7 Stunden und 2 μM Oligomycin A für 1 Stunde (n = 3–5). j Das Membranpotential von B. ovatus, behandelt mit Metformin für 7 Stunden (n = 5). k Das NADH/NAD+-Verhältnis von B. ovatus, behandelt mit 10 mM Metformin für 7 Stunden (n = 6). P-Wert bestimmt durch die einfaktorielle ANOVA mit Tukey- oder Dunnett-Tests (c, d, f–h), dem Kruskal-Wallis-Test (i) und dem Mann-Whitney-U-Test (e, j, b). Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM oder Mittelwert ± SD dargestellt.

Das fdnH-Gen von E. coli, das eine Untereinheit der Formiatdehydrogenase kodiert, die an der NAD-abhängigen anaeroben Nitratatmung beteiligt ist, wurde herunterreguliert (Abb. 3c). Durch Signalweganalyse zeigten die Sequenzierungsdaten, dass die Behandlung mit Metformin zu einer verminderten Transmembrantransporteraktivität/Vitaminbindungs-GO-Funktionen und einer Herunterregulierung des KEGG-Signalwegs des Selenverbindungsstoffwechsels führte, was darauf hindeutet, dass die ATPase-Funktion und der Methionin-Biosyntheseweg durch die Metformin-Behandlung verändert wurden (ergänzende Abbildung 4a). , B). Im Gegensatz zu TBDTs, die durch eine protonentreibende Kraft angetrieben werden, ist das IM-Protein BtuCD ein ATP-Bindungskassettentransporter (ABC), der Verbindungen durch die Phospholipiddoppelschicht pumpt und durch die Hydrolyse von ATP22 ausgelöst wird. Metformin kann den Atmungskomplex I hemmen, um die ATP-Synthese bei Säugetieren zu verringern. Um zu testen, ob Metformin auch die bakteriellen Elektronentransportketten bei der ATP-Synthese stört, haben wir anschließend die intrazelluläre ATP-Produktion nachgewiesen. Wie erwartet wurde festgestellt, dass die Behandlung mit Metformin (1,5 mM und 10 mM) den ATP-Spiegel in E. coli senkt (Abb. 3d). Atmungskettenkomplexe (Komplexe I, III und IV) sind Protonenpumpen, die den elektrochemischen Protonengradienten aufrechterhalten, der von der ATP-Synthase genutzt wird, um bei der Erzeugung zellulärer Energie ATP aus ADP zu erzeugen23. Konsequenterweise wurde das E. coli-Membranpotential durch die Metformin-Behandlung unterdrückt, wie aus dem Bakterienmembranpotentialtest ermittelt wurde (Abb. 3e). Der Bakterienkomplex I spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des elektrochemischen Protonenpotentials, wobei NADH zusammen mit der H+-Dissoziation zu NAD+ oxidiert wird, um die protonentreibende Kraft zu erzeugen24. Wir fanden heraus, dass das NADH/NAD+-Verhältnis in E. coli nach der Behandlung mit 1,5 mM Metformin signifikant höher war, was möglicherweise zum beeinträchtigten Membrangradienten beiträgt (Abb. 3f). Ein hochenergetisches Elektron wird entlang einer Elektronentransportkette zu Elektronenakzeptoren weitergeleitet. Dimethylsulfoxid (DMSO), Trimethylamin-N-oxid (TMAO) und Nitrat können von der anaeroben Atmung von E. coli als terminale Elektronenakzeptoren verwendet werden25. Wie Abb. 3f zeigt, wurde das durch die Metformin-Behandlung induzierte erhöhte NADH/NAD+-Verhältnis während des anaeroben Wachstums durch die Zugabe dieser terminalen Elektronenakzeptoren beseitigt.

Im Gegensatz dazu deuteten die Sequenzierungsdaten darauf hin, dass die Behandlung mit Metformin zu einer Erhöhung der GO-Funktionen der Eisenbindung und einer Hochregulierung des Ribosomen-KEGG-Signalwegs führte, was darauf hindeutet, dass der Metallionentransport und das Bakterienwachstum durch die Behandlung mit Metformin in B. ovatus gefördert wurden (ergänzende Abbildung 4c, d ). Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die Expression nicht nur von atpC, sondern auch anderer Gene, die ATP-Synthasen kodieren (z. B. atpD und atpE), durch die Metformin-Behandlung in B. ovatus erhöht wurde (Abb. 3g). Darüber hinaus erhöhte die Metformin-Behandlung erwartungsgemäß den intrazellulären ATP-Spiegel in B. ovatus (Abb. 3h). Oligomycin A senkte als Inhibitor der ATP-Synthasen den ATP-Spiegel stark, was durch Metformin (1,5 mM) leicht umgekehrt werden konnte (Abb. 3i). Für Komplex I konnte nur eine hohe Konzentration von Metformin (10 mM) das Membranpotential erhöhen und das NADH/NAD+-Verhältnis verringern (Abb. 3j, k), was darauf hindeutet, dass die Behandlung mit Metformin die ATP-Produktion in B. ovatus hauptsächlich durch seine Wirkung steigerte Komplex V anstelle von Komplex I in der Atmungskette.

Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass Metformin die Elektronentransportkette des Bakteriums über Komplex I oder V verändern könnte, um die ATP-Synthese zu beeinflussen.

Um den Einfluss der B. ovatus-Häufigkeit auf die Wirkung der Metformin-Behandlung auf die VB12-Disposition weiter zu validieren, haben wir In-vivo-Tierstudien entwickelt (Abb. 4a). Die Kolonisierung von B. ovatus in Mäusen mit verminderter Mikrobiota wurde durchgeführt. Nach einer zehnwöchigen Behandlung mit Antibiotika und anschließender B. ovatus-Transplantation bei Mäusen, denen eine fettreiche Diät verabreicht wurde, war die Häufigkeit von B. ovatus sowohl im Dickdarm (Abb. 4b) als auch im Dünndarm (Abb. 4c) deutlich erhöht. Durch Komplexierung mit einem IF kann VB12 in die Ileumzelle internalisiert werden, wo der Komplex in Lysosomen abgebaut wird, um VB12 freizusetzen, und dann wird VB12 in den Pfortaderkreislauf exportiert15. Und BtuG, ein Protein auf der Oberfläche von Bacteroides, könnte VB12 mit hoher Affinität aus IFs entfernen und mit btuFCD für die VB12-Aufnahme koppeln19. Daher ist zu erwarten, dass B. ovatus bei der Kolonisierung des Dünndarms mit dem menschlichen Wirt um die VB12-Aufnahme konkurriert. In tierischen Zellen unterstützt VB12 die Methioninsynthase bei der Katalyse der Methylierung von Homocystein zu Methionin oder unterstützt die Methylmalonyl-CoA-Mutase bei der mitochondrialen Umwandlung von Methylmalonyl-CoA in Succinyl-CoA15. Daher könnte ein niedriger VB12-Spiegel diese biochemischen Reaktionen hemmen, was zu einer zellulären Akkumulation von Homocystein (Hcy) oder Methylmalonsäure (MMA) und in der Folge zu einem erhöhten Risiko für Komplikationen (z. B. Hyperhomocysteinämie) führen könnte. Nach vierwöchiger Metformin-Behandlung war die Gesamtkonzentration von VB12 im Serum bei den Mäusen mit B. ovatus-Implantation im Darm niedriger als bei denen, die keine Metformin-Behandlung erhielten, und die Serumkonzentration von MMA, einem typischen Blutbiomarker der VB12-Homöostase, war signifikant höher (Abb. 4d, e). Konsequenterweise waren auch die Hcy-Werte von mit B. ovatus kolonisierten Mäusen durch die Metformin-Behandlung erhöht. Darüber hinaus war der Folatspiegel nach Metformin-Behandlung und/oder B. ovatus-Kolonisierung signifikant reduziert (Abb. 4f, g).

a Einführung des B. ovatus-Stammes bei Mäusen mit verminderter Mikrobiota (n = 5 Mäuse/Gruppe). b, c Faltenänderungen der relativen Häufigkeit von B. ovatus im Dickdarminhalt bzw. Dünndarminhalt von Mausempfängern basierend auf q-PCR-Analyse (n = 5). d Die Konzentrationen von Plasma VB12 (n = 5). e Die Konzentrationen von Plasma-Methylmalonsäure (MMA) (n = 5). f Die Konzentrationen von Plasma-Homocystein (Hcy) (n = 5). g Die relativen Plasmafolatspiegel (n = 5). h Leber-TG-Spiegel (n = 5). i Oil Red O-Färbung auf Lebergewebe; Maßstabsbalken, 50 μm (n = 3). j H&E-Färbung von subkutanem Fett (sWAT); Maßstabsbalken, 100 μm (n = 3). k Adiponektin-immunhistologische Färbung von SWAT-Schnitten; Maßstabsbalken, 50 μm (n = 3). l Repräsentative Bruttobilder des perigonadalen Fetts von HFD- und B.ovatus-kolonisierten Typ-2-Diabetes-Mäusen, die 4 Wochen lang mit Vehikel oder Metformin behandelt wurden. m Abschnitte der Bauchspeicheldrüse von Mäusen wurden mittels Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern gegen Insulin (rot) und Glucagon (grün) analysiert. Maßstabsbalken, 100 μm (n = 3). P-Wert bestimmt durch den Mann-Whitney-U-Test (b, c, h), einfaktorielle ANOVA mit Tukey- oder Dunnett-Tests (d, e, g) und Kruskal-Wallis-Test (f). Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM oder Mittelwert ± SD dargestellt.

Cholin könnte aus dem neu gebildeten Phosphatidylcholin in der Leber hergestellt werden. Die biochemische Reaktion erfordert S-Adenosylmethionin als Methyldonor, der durch die VB12- und Folsäurespiegel reguliert wird und die zelluläre Methylierungskapazität widerspiegelt26. Daher kann ein niedriger VB12- oder Folsäurespiegel in der Leber die Cholinverfügbarkeit verringern, was zu einer Fehlregulation des Cholesterinstoffwechsels und Lebersteatose führt. Die Behandlung mit Metformin reduzierte die Fettablagerung bei mit HFD gefütterten Mäusen deutlich. Wir fanden heraus, dass die Wirksamkeit von Metformin gegen HFD-induzierte Fettablagerungen in der Leber durch die Besiedlung mit B. ovatus erheblich beeinträchtigt wurde (Abb. 4h, i). Darüber hinaus konnte die Metformin-Behandlung zwar die Größe der Adipozyten im Fettgewebe verringern, dieser Effekt wurde jedoch bei Mäusen mit Darmimplantation von B. ovatus aufgehoben. Konsequenterweise wurde der vorteilhafte Anstieg der Adiponektin-Expression im Fettgewebe nach Metformin-Behandlung bei HFD-gefütterten Mäusen bei Mäusen mit B. ovatus-Implantation im Darm nicht beobachtet (Abb. 4j – l). Folsäure (FA) und VB12 können das Versagen der Betazellen der Bauchspeicheldrüse verhindern, indem sie oxidativen Stress unterdrücken27. Immunhistochemische und stereologische Untersuchungen zeigten, dass das Inselvolumen bei HFD-gefütterten Mäusen nicht durch die Metformin-Behandlung allein oder die Darmimplantation von B. ovatus allein beeinflusst wurde; Allerdings war das Inselvolumen bei den mit HFD gefütterten Mäusen, die sowohl eine Metformin-Behandlung als auch eine B. ovatus-Implantation im Darm erhielten, viel kleiner, zusammen mit einer verringerten Anzahl von Betazellen, die zwischen einer erhöhten Anzahl von Alphazellen verstreut waren (Abb. 4m).

Darüber hinaus wurde berichtet, dass VB12 und FA natürliche Antagonisten des Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptors (AhR) sind, die die Kernlokalisierung von AhR blockieren können28. Wir fanden heraus, dass die Verabreichung von Metformin bei mit B. ovatus kolonisierten Mäusen die relative Expression von AhR und seinem nachgeschalteten Ziel CYP1A1 in der Leber induzieren konnte, was bei den mit HFD gefütterten Mäusen, die nur eine Metformin-Behandlung oder nur eine B. ovatus-Implantation im Darm erhielten, nicht nachgewiesen wurde ( Abb. 5a, b).

a Relative mRNA-Häufigkeit von Ahr, seinem Zielgen Cyp1a1 in der Leber (n = 5). b Western-Blot-Analyse (Zuschneiden von Blot-Bildern) der hepatischen AHR- und CYP1A1-Proteinexpression und das statistische Diagramm (n = 3). c Vulkandiagramm von signifikant hochregulierten (rot), herunterregulierten (grün) Genen und nicht signifikanten (blau) Genen in B. ovatus + MET- und Metformin-Gruppenmäusen (n = 3). d Anreicherungsdiagramme des Vitaminverdauungs- und -absorptionswegs, angereichert mit der Gen-Set-Enrichment-Analyse (GSEA), die das Profil des laufenden ES-Scores und die Positionen der Gen-Set-Mitglieder in der Rangliste (n = 3) zeigen. e Relative mRNA-Spiegel der VB12-Absorptions- und Transportgene (n = 5). f Relative mRNA-Expression von Folsäure-Absorptionsgenen (n = 5). P-Wert bestimmt durch den zweiseitigen ungepaarten Student-t-Test (a, b), die einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Tests (e, f) und den Kruskal-Wallis-Test (e, f). Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM oder Mittelwert ± SD dargestellt.

Um Veränderungen in der Cobalaminabsorption bei Wirtsmäusen weiter aufzudecken, führten wir eine RNA-Seq-Analyse mit Ileumgeweben durch. Insgesamt wurden 3034 differenziell exprimierte Gene (DEGs) zwischen den HFD-gefütterten Mäusen, die nur eine B. ovatus-Implantation im Darm erhielten, und denen, die zusätzlich eine Metformin-Behandlung erhielten, identifiziert (Abb. 5c). In der KEGG-Signalweganalyse wurde festgestellt, dass diese Gene, einschließlich derjenigen, die für den IF-VB12-Rezeptorkomplex (Cubn) kodieren, an Vitaminverdauungs- und Absorptionswegen angereichert sind (Abb. 5d und ergänzende Abb. 5a). Darüber hinaus zeigten die Sequenzierungsdaten auch, dass die Behandlung mit B. ovatus + Metformin zu einem erhöhten Metabolismus wasserlöslicher Vitamine im Reaktomweg und einer Hochregulierung der Cofaktor-bindenden GO-Funktion führte (ergänzende Abbildung 5b, c). Wir untersuchten außerdem die relative Expression der Gene, die an der Aufnahme/dem Abbau von IF-VB12 und dem Efflux/Transport von IF-VB12 beteiligt sind. Es wurden keine signifikanten Veränderungen zwischen den mit HFD gefütterten Mäusen, denen nur eine B. ovatus-Implantation im Darm verabreicht wurde, und denen, die zusätzlich eine Metformin-Behandlung erhielten, festgestellt. Allerdings war die Expression dieser Gene bei den mit HFD gefütterten Mäusen, die nur eine Metformin-Behandlung erhielten, insgesamt geringer (Abb. 5e). Das Slc46a1-Gen kodiert für ein Transmembran-Protonen-gekoppeltes Folat-Transporterprotein, von dem berichtet wurde, dass es bei Mäusen mit Folatmangel erhöht ist29. Die Expression von Slc46a1 war in der B. ovatus + MET-Gruppe im Vergleich zur B. ovatus-Gruppe signifikant hochreguliert, nicht jedoch von Slc19a1 (Abb. 5f, ergänzende Abb. 5d). Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass die Anreicherung von B. ovatus im Darm den Metformin-induzierten VB12-Mangel verschlimmern kann, indem Cobalamin eingefangen wird, anstatt die Absorption von VB12 zu stören.

Klinische Manifestationen eines VB12-Mangels, wie klassische Megaloblastenanämie, Hyperhomocysteinämie, periphere Neuropathie und kognitive Defizite, können den potenziellen Nutzen von Metformin verringern. Obwohl es klassische Blutbiomarker gibt (Gesamt-VB12, Holotranscobalamin, Hcy und MMA), ist die Diagnose eines VB12-Mangels aufgrund seines Zusammenhangs mit anderen Krankheiten wie Autoimmunerkrankungen, Niereninsuffizienz und Alzheimer-Krankheit schwierig15. Eine Vielzahl von Faktoren könnte zum VB12-Mangel beitragen, wie z. B. ein Mangel an VB12-haltiger Nahrungsaufnahme, eine Verringerung der Magensäureproduktion, Veränderungen der kalziumabhängigen Membranfunktion und das Vorhandensein von SIBO, ein Mangel an intrinsischem Faktor und eine lysosomale Dysfunktion. VB12 wird nur von bestimmten Bakterien und Archaeen synthetisiert und ist aufgrund von Mikroben-Wirt-Interaktionen von Tieren oder Fischen verfügbar15. Obwohl Pflanzen kein VB12 enthalten, wird Patienten mit Typ-2-Diabetes in der Regel empfohlen, mehr Obst, Gemüse, Vollkornprodukte und Hülsenfrüchte zu sich zu nehmen und weniger rotes Fleisch, gesättigte Fette und kohlenhydratreiche Lebensmittel zu sich zu nehmen. Einige Patienten entscheiden sich sogar dafür, Vegetarier zu werden, was ihre Nahrungsquellen für VB12 einschränkt und auch die Zusammensetzung ihrer Darmmikrobiota verändern kann. Obwohl die Mikrobiota eine wichtige Rolle bei der Bereitstellung essentieller Cofaktoren für den Wirt spielt, reichern sich mikrobielle VB12-Quellen normalerweise eher bei pflanzenfressenden Wiederkäuern als beim Menschen an. Darüber hinaus könnte die Darmmikrobiota VB12 aus der Nahrung in alternative Corrinoide umwandeln, die für den Menschen nur schwer direkt verwertbar sind19. Daher kann die Darmmikrobiota, der Vitamin-Biosynthesewege fehlen, die VB12-Absorption des Wirts beeinträchtigen. Das Hindernis, das die Mikrobiota für die Absorption von VB12 durch den Wirt darstellt, muss jedoch noch bestätigt werden, insbesondere im Zusammenhang mit der medikamentösen Therapie des Wirts.

B. ovatus ist ein weit verbreitetes menschliches Darmbakterium mit verschiedenen Polysaccharid-verwertenden Genorten30,31 und kann komplexe pflanzliche Ballaststoffe abbauen und auf ihnen wachsen. Es exprimiert für den Corrinoidtransport kodierende konjugative Transposons, die mobil sind und den Austausch von Genen bewirken, die für den Transport von Corrinoiden erforderlich sind, um die Kolonisierung zu ermöglichen21. Unsere Daten zeigen, dass B. ovatus den Dünndarm besiedeln könnte, um VB12 zu transportieren und den Metformin-induzierten VB12-Mangel im Wirt zu verschlimmern.

Die Verwendung von Metformin wurde mit Veränderungen in der Zusammensetzung des menschlichen Darmmikrobioms in Verbindung gebracht und könnte die Expression der Gene verändern, die für Metalloproteine ​​oder Metalltransporter in der Darmmikrobiota von Typ-2-Diabetes-Patienten kodieren32,33. Obwohl Metformin kein Antibiotikum ist, kann es das Wachstum einiger Bakterien wie B. fragilis34 und E. coli OP5035 hemmen, bei denen die Behandlung mit Metformin zu erhöhten 5-Methyl-Tetrahydrofolat-Spiegeln und verringerten Methionin-Spiegeln führen kann. Die Behandlung mit Metformin kann daher den Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel der Bakterien beeinträchtigen, der auf VB12 als Cofaktor angewiesen ist. Wir beobachteten, dass Metformin in der Lage war, den zellulären Gehalt an VB12 in diesen Bakterien durch Hochregulierung der TonB- oder btuB-Expression zu erhöhen. Das von IM-Proteinen eingefangene VB12 passiert jedoch möglicherweise nicht die innere zytoplasmatische Zellmembran, da die Aktivität der IM-ABC-Transporterproteine, die durch ATP-Hydrolyse aktiviert werden, durch Metformin beeinflusst werden könnte. Wir fanden heraus, dass Metformin die Elektronentransportkette in E. coli hemmen kann, was zu einer verminderten ATP-Produktion führt. Somit führten die erhöhte VB12-Konzentration und das hochregulierte TonB nicht zu einer erhöhten Expression von MetH und scpA aufgrund von ATP-defizientem ExbBD. Da Metformin jedoch die ATP-Synthase in B. ovatus hochregulieren konnte, konnte das von BtuB in diesem Stamm eingefangene VB12 kontinuierlich durch das Periplasma und dann in das Zytoplasma transportiert werden (Abb. 6). Tatsächlich könnten neben Cobalamin auch andere Substrate wie Eisenkomplexe, Nickelchelate und Kohlenhydrate durch TonB-abhängige Transporter importiert werden16. Diese Substrate sind wichtig für die Aufrechterhaltung des Bakterienwachstums und der menschlichen Gesundheit, da sie die Umwandlung chemischer Nährstoffe in Biomasse erleichtern. Daher liefern unsere Ergebnisse neue Einblicke in die Wirkung von Metformin auf die Interaktion zwischen der Darmmikrobiota und den Wirten.

Im Gegensatz dazu reguliert Metformin den Atmungskettenkomplex V von B. ovatus hoch, und VB12 könnte über die innere Membran zum Zytoplasma transportiert werden. Das Diagramm wurde mit BioRender erstellt.

Wir haben gezeigt, dass ein VB12-Mangel bei mit B. ovatus kolonisierten Mäusen leichter durch Metformin induziert werden kann, nicht jedoch bei Mäusen, die nur mit B. ovatus kolonisiert sind. Interessanterweise konnte die Absorption von VB12 bei mit HFD gefütterten Mäusen durch Metformin deutlich gehemmt werden, bei den Mäusen, die sowohl eine B. ovatus-Implantation als auch eine Metformin-Behandlung erhielten, wurde die Absorption interessanterweise nicht beeinträchtigt. Die Herunterregulierung der Genexpression stand im Zusammenhang mit mehreren Prozessen bei den Mäusen, die nur eine Metformin-Behandlung erhielten, darunter die Komplexierung von VB12 mit Cubilin (Cubn), der Transport von VB12 aus Lysosomen (Lmbrd1), die Umwandlung von VB12 in Adenosylcobalamin und Methylcobalamin (Mmachc ) und der Transport von VB12 vom Blutkreislauf zu den Zellen (Tcn2) deuteten darauf hin, dass Metformin die ileale Absorption von VB12 direkt stören könnte. Darüber hinaus hemmte Metformin die Aktivität der ATPase vom Vakuolentyp (V-ATPase) über die PEN2-ATP6AP1-Achse36. V-ATPase übt eine entscheidende Funktion bei der lysosomalen Ansäuerung aus, um saure Proteasen zu aktivieren, die für den Abbau von IF und die anschließende Freisetzung von VB12 in das Zytoplasma unerlässlich sind15. Somit könnte ein Metformin-induzierter VB12-Mangel auf eine lysosomale Dysfunktion zurückzuführen sein. Ein VB12-Mangel im Zusammenhang mit einer Langzeitbehandlung mit Metformin wurde bei Patienten aus verschiedenen Ländern und unterschiedlicher ethnischer Zugehörigkeit beobachtet37,38, mit einer sehr unterschiedlichen Prävalenz (zwischen 5,8 % und 33 %)2. Die hohe Heterogenität lässt sich kaum allein durch Wirtsfaktoren erklären. Im Darmtrakt jedes Menschen leben 500 bis 1000 verschiedene Mikrobenarten, und die Darmmikrobiota zeichnet sich durch eine große interindividuelle Variabilität aus, die durch genetische Variation, mütterliche Faktoren, Ernährung, physiologischen Zustand, Medikamente und sogar sozialen Stress reguliert wird und sich auf ihre Fähigkeit auswirkt besetzen und konkurrieren um begrenzten Raum und Ressourcen. Daher könnte die verblüffende Vielfalt dieser taxonomischen und funktionellen Kommensalgemeinschaften als vermittelnde Faktoren wirken, um den VB12-Status des Wirts zu beeinflussen. B. ovatus wurde bei 70,053 % der gesunden Menschen gefunden (n = 11.406, GMrepo). In unseren früheren Daten wiesen Personen mit Typ-2-Diabetes einzigartige relative Häufigkeiten zwischen 0 % und 32,5 % (n = 112) mit hoher Variation (1,31 % ± 3,73 %) auf, was auf die komplexe Wechselwirkung zwischen B. ovatus und dem Wirt schließen lässt in Bezug auf Cobalamin könnte sogar auf andere Bacteroides spp. ausgeweitet werden. Insgesamt unterstreichen unsere Ergebnisse die Bedeutung der Darmbakterien, insbesondere B. ovatus, beim VB12-Mangel im Zusammenhang mit der Einnahme von Metformin.

In dieser Studie haben wir B. ovatus als Mediator identifiziert, der den Plasma-VB12-Wert des Wirts unter Metformin-Behandlung reduzierte. Die genauen Domänenstrukturen der TonB-abhängigen Transporter im B. ovatus sind jedoch weiterhin unbekannt. Es wurde berichtet, dass die strukturellen Merkmale von TBDTs in B. thetaiotaomicron mindestens drei verschiedene Subtypen aufweisen, die die Nährstoffaufnahme auf unterschiedliche Weise regulieren39. B. ovatus setzt mehrere PUL ein, um verschiedene Arten komplexer Kohlenhydrate aufzunehmen, und könnte das Wachstum von P. vulgatus fördern40. Eine entscheidende Frage ist, ob B. ovatus auch einzigartige TBDTs zur Nährstoffverwertung kodiert, was noch zu bestimmen ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Typ-2-Diabetes-Patienten mit reichlich B. ovatus im Darm möglicherweise eher an einem VB12-Mangel leiden, wenn sie mit Metformin behandelt werden, was die bakterielle Kapazität zur VB12-Aufnahme erhöht. Metformin kann bei der Regulierung des bakteriellen Lebenszyklus und der Wechselwirkungen zwischen Wirt und Mikrobiota auf unterschiedliche Weise auf die Atmungskette einwirken. Daher kann eine routinemäßige Untersuchung der Serumspiegel von VB12 und Homocystein bei Patienten mit Typ-2-Diabetes, die mit Langzeit-Metformin behandelt werden, insbesondere bei Patienten mit hohem B. ovatus-Gehalt, in Betracht gezogen werden. Den verschiedenen Sicherheitsaspekten von Metformin sollte angesichts der einzigartigen persönlichen Darmmikrobiota, insbesondere der Korrelation von DPN mit Bakterien, mehr Aufmerksamkeit geschenkt werden.

Probanden, bei denen zwischen April 2019 und Juni 2020 im Zhengzhou Central Hospital der Universität Zhengzhou Typ-2-Diabetes diagnostiziert wurde, wurden nach strengen Einschluss- und Ausschlusskriterien rekrutiert: Für die Studie wurden chinesische Patienten mit neu diagnostiziertem T2DM rekrutiert (im Alter von 18–65 Jahren; 18,5 kg). /m2 < BMI < 35,0 kg/m2) und wurde vor dieser Studie noch nie mit Antidiabetika behandelt. Die Ausschlusskriterien waren: (1) Typ-1-Diabetes, Schwangerschaftsdiabetes oder anderer sekundärer Diabetes; (2) kontinuierliche Einnahme von Antibiotika oder Probiotika für > 3 Tage innerhalb von 3 Monaten vor der Einschreibung; (3) innerhalb von 3 Monaten vor dieser Studie trat ein schweres Hypoglykämieereignis (Blutzuckerspiegel ≤ 3,9 mmol/l) unbekannter Ursache auf; (4) eine Vorgeschichte von diabetischer Ketoazidose, Laktatazidose oder nichtketotischem hyperosmolarem Syndrom; (5) Organversagen oder klinisch bedeutsame Komplikationen: schwere Lebererkrankungen (einschließlich chronisch persistierender Hepatitis, Leberzirrhose oder gleichzeitiges Auftreten eines positiven Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigens und einer abnormalen Lebertransaminase (Serumkonzentrationen von Alanintransaminase oder Aspartattransaminase > 2,5 ×). obere Normgrenze); schwere Nierenerkrankung (Kreatinin > 2 mg/dl); schwere organische Erkrankungen, einschließlich Krebs, koronare Herzkrankheit, Myokardinfarkt oder Hirnschlag; Infektionskrankheiten, einschließlich Lungentuberkulose und HIV-Träger; schwere diabetische Komplikationen (diabetische Retinopathie). , diabetische Neuropathie, diabetische Nephropathie und diabetischer Fuß); Funktionsstörung der Hypophyse; Transplantatempfänger; Magen-Darm-Operation (außer Blinddarmentzündung oder Hernienoperation); schwere psychische Erkrankung innerhalb von 6 Monaten vor der Einschreibung; Blutungskrankheit oder Blutungsneigung; systolischer Blutdruck ≥ 160 mmHg oder diastolischer Blutdruck ≥ 100 mmHg; Anämie (bei Männern weniger als 12,0 Gramm pro Deziliter); bei Frauen weniger als 11,0 Gramm pro Deziliter); (6) immunologische endokrine Störungen im Zusammenhang mit hohem Blutzucker; (7) kontinuierliche Einnahme von Medikamenten zur Gewichtsabnahme über einen Zeitraum von > 1 Monat; (8) Alkoholismus; (9) Arzneimittelallergie und hohe Empfindlichkeit gegenüber Umweltsubstanzen; (10) Behandlung mit mäßigen und starken Induktoren oder Inhibitoren von CYP3A4; (11) Schwangerschaft, Stillzeit, Schwangerschaftsabsicht im Verlauf der Studie.

Den Teilnehmern wurde eine Metforminhydrochlorid-Behandlung verabreicht (1000 mg BID für 1–2 Wochen, dann 2000 mg pro Tag, Sino-American Shanghai Squibb Pharmaceuticals Ltd.). Eine solche Behandlung dauerte 12–24 Wochen. Die Teilnehmer wurden der Mangelgruppe (Serum-Gesamt-VB12 < 200 pg/ml) oder der Nicht-Mangel-Gruppe (Serum-Gesamt-VB12 > 200 pg/ml) zugeordnet. Am Ende der Interventionsperiode wurden anthropometrische Messungen, biologische Proben und Stoffwechseltests durchgeführt. Periphere Blutproben wurden 10 Minuten lang bei 3320 g und 4 °C zentrifugiert, um das Plasma zu erhalten. Die Werte der biochemischen Indikatoren im Blut wurden mit einem Autoanalysator gemessen. Der Kot wurde gesammelt und bis zur Analyse bei –80 ° C gelagert.

Menschliche fäkale genomische DNA wurde mit einem Magnetic Soil and Stool DNA Kit (TIANGEN Biotech) extrahiert und auf der illumina novaseq-Plattform sequenziert, und es wurden 150 bp Paired-End-Reads generiert. Nach dem Entfernen minderwertiger Reads (mit einem Qualitätsfaktor < 20), Sequenzierungsadaptern und Reads mit einer Länge von weniger als 80 bp mithilfe von Trim Galore erhielten wir durchschnittlich 72,6 Millionen (Bereich 65,9 bis 86,2 Millionen) qualitativ hochwertige, saubere Reads für jede Stuhlprobe . Saubere Lesevorgänge wurden mit Bowtie2 (Version 2.3.1, Standardparameter) dem menschlichen Referenzgenom (http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/) zugeordnet. Die nicht zugeordneten Lesevorgänge wurden mithilfe der metaSPAdes (SPAdes-3.13.1, k-mer-Größen: 21, 33, 55, 77) zusammengestellt und von QUAST gesteuert. Anschließend wurden die Contigs mit mehr als 500 bp zur Vorhersage von Genen mit MetaGeneMark (GeneMark.hmm Version 3.38) verwendet. Mit CD-HIT wurde ein nicht-redundanter Genkatalog mit einem Sequenzidentitäts-Cutoff von 0,9 und einem minimalen Coverage-Cutoff von 0,9 für die kürzeren Sequenzen erstellt. Die Häufigkeit der Gene in jeder Probe wurde durch Kartierung des nicht-redundanten Genkatalogs, Zählung der Anzahl ausgerichteter Lesevorgänge (Samtools-Tiefe, Standardparameter) und Normalisierung anhand der Genlänge berechnet und dann in die relative Häufigkeit umgerechnet (10000000 × (x/ Summe(x))). Die taxonomische Profilierung metagenomischer Proben wurde mit MetaPhlAn 4.0.6 durchgeführt (mit Referenzdatenbank mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212, einschließlich taxonomischer Klassifizierung von Bakterien, Archaeen und Pilzen)41. Die funktionellen Annotationen neu zusammengesetzter Gene wurden mit KOBAS (Version 3.0, Standardparameter) gegen das KEGG (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/) durchgeführt. Die Häufigkeit einer KEGG-Orthologie/eines KEGG-Moduls wurde durch Summieren der Häufigkeit von Genen berechnet, die mit demselben Merkmal annotiert sind. Downstream-Analysen wurden im R (Version 3.5.1; 4.2.0) mit mehreren Paketen durchgeführt, darunter reshape2, vegan, ggplot2, Maaslin2 und ALDEx2. Die Beta-Diversität wurde auf der Grundlage von Bray-Curtis-Abständen (normalisierte Daten) und einer Distanzmatrix berechnet, die zur Durchführung einer Ordinations-Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) verwendet wurde. Die LEfSe-Analyse wurde mit Galaxy42 durchgeführt. Bubble Plot wurde mit dem Online-Tool der Majorbio Cloud Platform (https://cloud.majorbio.com/page/tools/) analysiert. Die zufällige maschinelle Lernklassifizierung von Wäldern wurde mithilfe des R-Pakets „randomForest“ mit 500 Bäumen und einer zehnfachen Kreuzvalidierung durchgeführt, um optimale mikrobielle Biomarker zu identifizieren.

B. ovatus (ATCC 8483) wurde 48 Stunden lang in einem anaeroben Arbeitsplatz bei 37 °C (10 % CO2, 10 % H2 und 80 % N2) auf eine Gehirn-Herz-Infusions-Agarplatte (BHI, OXOID) ausgestrichen. Eine einzelne Kolonie wurde zum Animpfen von 5 ml BHI (ergänzt mit 5 % FBS) verwendet, und die Impfkulturen wurden bis zu ihrer logarithmischen Wachstumsperiode 7–8 Stunden lang bei 37 °C suspendiert. Escherichia coli K-12 MG1655 wurde 48 Stunden lang in einer aeroben Arbeitsstation bei 37 °C auf eine Luria-Bertani-Brühe-Agarplatte (LB, Invitrogen) ausgestrichen. Die Saatkulturen einer einzelnen Kolonie wurden bis zu ihrer logarithmischen Wachstumsperiode 3–4 Stunden lang bei 37 °C suspendiert. Bakterien wurden in 96 Multiwellplatten in Gegenwart oder Abwesenheit von Metformin (40 μM, 1,5 mM und 10 mM, Sigma-Aldrich) ausgesät und die OD600-Werte wurden stündlich mit einem BioTekEon-Mikroplattenspektrophotometer gemessen.

Zur Kolonisierung von Bakterien wurde B. ovatus, suspendiert in 200 μl anaerobem PBS (1,0 × 108 koloniebildende Einheiten pro Maus), den Mäusen 10 Wochen lang täglich oral verabreicht.

Die Konzentration von Cyanocobalamin in Bakterien wurde durch eine hochempfindliche und selektive Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS; AB SCIEX, USA, Triple Quad 6500 +) gemessen. Kurz gesagt, E. coli wurde in LB-Medium gezüchtet und über Nacht aerob bei 37 °C inkubiert und dann in einem M9-Medium ohne Cobalamin gehalten und vermehrt. Die E. coli wurden 1 Stunde lang im Dunkeln mit 3,7 nM Cyanocobalamin (Sigma-Aldrich) und Metformin (0, 40 μM, 1,5 mM und 10 mM) behandelt. B. ovatus wurde in Minimalmedien (KH2PO4 (100 mM), NaCl (15 mM), (NH4)2SO4 (8,5 mM), L-Cystein (4 mM), VK3 (1 μg/ml), Hämatin (1,9 μM) gezüchtet ), L-Histidin (200 μM), MgCl2 (100 μM), FeSO4.7H2O (1,4 μM), CaCl2 (50 μM), Glucose (0,50 %)), gegebenenfalls ergänzt mit 3,7 nM Cyanocobalamin und Metformin (0, 40 μM). , 1,5 mM und 10 mM) im Dunkeln für 7 Stunden. Als nächstes wurden die Bakterien pelletiert und dreimal mit 1× PBS (pH 7,4) gewaschen, und 100 μl MilliQ-Wasser mit internen Standards (IS, Methotrexat, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) wurden dem Bakterienpellet zugesetzt. Dann wurde die Mischung mit 300 μl kaltem 20:80 H2O:MeOH (0,1 % Ascorbinsäure und Beta-Mercaptoethanol) verwirbelt und beschallt. Als nächstes wurden 400 μl kaltes MeOH zugegeben und erneut gevortext, um es 8 Stunden lang bei –80 °C zu lagern. Die Überstände wurden gesammelt, unter einem N2-Strom getrocknet, in der mobilen Phase resuspendiert und in einem Autosampler bei 4 °C aufbewahrt. Ein Aliquot von 3 μl Überstand wurde mittels LC-MS/MS analysiert. Die Flussrate wurde auf 0,3 ml/min eingestellt. Die chromatographische Trennung wurde auf einer analytischen Säule ACQUITY UPLC HSST3 C18 (1,8 μm, 2,1 mm x 100 mm) durchgeführt. Die mobile Phase enthielt eine Mischung aus 0,1 % Ameisensäure in Wasser (A) und Acetonitril (B). Die Gradientenelution wurde angewendet und die MS-Detektion erfolgte im positiven Modus. Die Daten wurden mit einem Mehrfachreaktionsmonitor gesammelt. Die für die Methode optimierten MS/MS-Parameter sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Der Gradient wurde wie folgt eingestellt: 10 %–30 % B bei 0–4 Min., 30 %–10 % B bei 4–5 Min. Die Erfassungsdaten waren analysiert mit Analyst Software für Peakintegration, Kalibrierungsgleichungen und Quantifizierung von Cyanocobalamin. Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem 2-D Quant Kit (GE Healthcare) quantifiziert, um die Bakterienmenge zu normalisieren.

(i) Die untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) und der Linearität: Die Peakflächenverhältnisse für diese Verbindungen und IS wurden berechnet, um die Kalibrierungskurven mit gewichteter linearer Regression der kleinsten Quadrate (1/x) zu erstellen. Der LLOQ war die niedrigste Konzentration, die mit akzeptabler Präzision und Genauigkeit quantifiziert werden konnte. Und die Spitzenintensität betrug mindestens das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) von etwa 10. Die Daten sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt. (ii) Präzision und Genauigkeit innerhalb und zwischen Tagen: Hoch, Mittel Zur Bewertung der Präzision und Genauigkeit innerhalb und zwischen Tagen wurden Qualitätskontrollproben mit niedriger Konzentration hergestellt. Dabei muss das Verhältnis der ermittelten Konzentration zur hinzugefügten Konzentration innerhalb eines Tages oder an drei aufeinanderfolgenden Tagen zwischen 85 % und 115 % liegen . Die Intra- und Inter-Day-Präzision und -Genauigkeit für alle diese Analyten sind in der Ergänzungstabelle 4 dargestellt. (iii) Extraktionsrückgewinnung und Matrixeffekt: Die Bewertung eines geeigneten Extraktionsmittels wurde durch Berechnung der Extraktionsrückgewinnung und des Matrixeffekts beurteilt. Die Extraktionsausbeute wurde anhand des Analyt/IS-Peakflächenverhältnisses (A1) berechnet, das aus extrahierten biologischen Proben ermittelt wurde, im Vergleich zu denen (A2), die nach der Extraktion aus diesen QC-Probenlösungen mit denselben Konzentrationen versetzt wurden. Die Matrixeffekte wurden durch das Verhältnis der Peakflächen von A2 und denen der Arbeitslösungen dargestellt, die äquivalente Mengen dieser Verbindungen (A3) enthielten. Extraktionsrückgewinnung und Matrixeffekt aller Verbindungen sind in der Ergänzungstabelle 5 angegeben.

Die Gesamt-RNA wurde aus E. coli oder B. ovatus mit dem RNeasy Protect Bacteria Mini Kit (Qiagen) extrahiert und auf der illumina novaseq 6000-Plattform sequenziert, und es wurden 150 bp Paired-End-Reads generiert. Drei biologische Replikatkulturen von B. ovatus oder E. coli wurden 7 Stunden lang unter Metformin (0 mM oder 1,5 mM) gezüchtet. Die Sequenzierungsreaktionen der zwölf Proben ergaben jeweils zwischen 24,2 und 30,9 Millionen saubere Lesevorgänge; Alle Proben enthielten etwa 93 % Basen mit einem Qualitätsfaktor von mehr als 30. Die RNA-seq-Daten wurden mit FastQC ausgewertet. Die bereinigten Lesevorgänge wurden mithilfe von Bowtie2 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) dem Referenzgenom (GCF_000154125.1_ASM15412v1_genomic.fna und GCF_000005845.2_ASM584v2_genomic.fna) zugeordnet. HTSeq 0.6.1p2 (http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq) wurde verwendet, um die mit einem Gen verknüpfte Gesamtlesezahl zu ermitteln. Die unterschiedlich exprimierten Gene wurden sowohl von DESeq2 als auch von EdgeR bewertet (P-Wert war kleiner oder gleich 0,05). Der Vulkanplot wurde in R 4.2.0 und den R-Paketen (ggpubr und ggthemes) erstellt.

E. coli wurde in LB-Medium gezüchtet und 7 Stunden lang aerob bei 37 °C inkubiert und dann 1 Stunde lang im Dunkeln mit Metformin (0, 40 μM, 1,5 mM und 10 mM) behandelt. B. ovatus wurde in BHI-Medium (ergänzt mit 5 % FBS), ergänzt mit Metformin (0, 40 μM, 1,5 mM und 10 mM), im Dunkeln 7 Stunden lang gezüchtet und dann 1 Stunde lang mit Vehikel oder Oligomycin A (2 μM) inkubiert H. Der intrazelluläre ATP-Spiegel wurde mit dem ATP Assay Kit (Beyotime) bestimmt. Und die Proteinkonzentrationen von Bakterienhomogenaten wurden mittels BCA-Assay (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert.

E. coli wurde in LB-Medium gezüchtet und 7 Stunden lang aerob bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde es 1 Stunde lang im Dunkeln mit Metformin (0 und 1,5 mM) behandelt. B. ovatus wurde in BHI-Medium (ergänzt mit 5 % FBS), ergänzt mit Metformin (0, 40 μM, 1,5 mM und 10 mM), 7 Stunden lang im Dunkeln gezüchtet. Das Bakterienmembranpotential wurde mit dem BacLight™ Bacterial Membrane Potential Kit (Thermo Fisher Scientific) nachgewiesen. Kurz gesagt, E. coli oder B. ovatus wurden in 1X PBS resuspendiert und entweder 5 Minuten oder 10 Minuten lang mit 10 mM EDTA behandelt. Die mit EDTA behandelten Bakterien wurden zentrifugiert und in 1X PBS resuspendiert. Den Bakterien wurde eine 3 mM DiOC2(3)-Stammlösung in DMSO zugesetzt (Endvolumen 200 μl in einer undurchsichtigen 96-Well-Mikroplatte), um eine Endkonzentration von 30 μM zu erreichen. 15 Minuten nach der Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Membranpotential mit einem Fluoreszenzlesegerät unter Ex450/Em670 nm erfasst.

E. coli wurde in LB-Medium gezüchtet und 7 Stunden lang aerob bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde es 1 Stunde lang im Dunkeln mit Metformin (0 und 1,5 mM) und/oder terminalen Elektronenakzeptoren (DMSO (1 %); TMAO (4 μM) und NaNO2 (18 mM)) behandelt. B. ovatus wurde in BHI-Medium (ergänzt mit 5 % FBS), ergänzt mit Metformin (0 und 10 mM), 7 Stunden lang im Dunkeln gezüchtet. Die gesamten intrazellulären NAD+- und NADH-Spiegel wurden mit einem Amplite™ Fluorimetric NAD+/NADH Ratio Assay Kit *Rote Fluoreszenz gemessen. Kurz gesagt, Bakterien wurden in Lysepuffer homogenisiert und dann zentrifugiert. Als nächstes wurde der Überstand in NAD+- oder NADH-Extraktionspuffer 15 Minuten lang auf 37 °C erhitzt und das gleiche Volumen des entgegengesetzten Extraktionspuffers wurde hinzugefügt, um die Probe zu neutralisieren. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur konnte ein Fluoreszenzanstieg von Standards oder Proben mit einem Fluoreszenzlesegerät unter Ex540/Em590 nm nachgewiesen werden.

Die genomische DNA des Stuhl- und Dünndarminhalts wurde mit dem QIAamp PowerFecal Pro DNA-Kit extrahiert. Die RT-qPCR wurde durchgeführt, um die relative Häufigkeit von B. ovatus zu quantifizieren.

RNA wurde mithilfe einer Heißphenolmethode aus Bakterien extrahiert. Und RNA wurde mit Trizol-Reagenz (Invitrogen) unter Verwendung einer Standard-Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion aus Geweben extrahiert. 1 μg Gesamt-RNA wurde mit einem Transkriptionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers revers transkribiert. Die relativen mRNA-Expressionsniveaus wurden durch qPCR unter Verwendung des QuantStudio 5 Real-Time PCR-Systems (Thermo Fisher Scientific) bestimmt. Die Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle 6 zusammengefasst.

Männliche SPF-Mäuse des Stammes C57BL/6J (Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd) wurden in einer pathogenfreien Tierhaltung unter Standardlaborbedingungen (12-stündige Licht- und Dunkelzyklen, wobei die Temperatur bei 21–24 °C gehalten wurde) gehalten und die Luftfeuchtigkeit liegt bei 40–70 % und es besteht freier Zugang zu Nahrung und Wasser. Den Mäusen wurde 7 Tage lang ein Antibiotika-Cocktail bestehend aus 50 mg/kg Vancomycin, 100 mg/kg Neomycin, 100 mg/kg Metronidazol, 1 mg/kg Amphotericin-B und 1 mg/ml Ampicillin verabreicht. Den Mäusen mit verminderter Darmflora (6 Wochen alt) wurde B. ovatus oder PBS transplantiert und sie wurden 10 Wochen lang ununterbrochen mit einer fettreichen Diät (HFD, 60 % kcal aus Fett, D12492, Research Diets) gefüttert.

Zwanzig Mäuse wurden zufällig in vier Gruppen eingeteilt und ihnen wurden die folgenden Wirkstoffe oral verabreicht (n = 5 Mäuse/Gruppe): (1) HFD-Gruppe: HFD + Vehikel; (2) Metformin-Gruppe: HFD + Metformin (200 mg/kg/Tag, 4 Wochen, p.o.); (3) B. ovatus-Gruppe: Kontrollvehikel; (4) B. ovatus + MET-Gruppe: Metformin (200 mg/kg/Tag, 4 Wochen, p.o.).

Die Tiere wurden mit Isofluran anästhesiert, um Blutproben durch retroorbitale Sinuspunktion zu entnehmen. Andere Proben (Leber, Ileum, Dünndarminhalt, Dickdarminhalt, Bauchspeicheldrüse und Fett) wurden gesammelt und bis zur Analyse bei –80 °C gelagert.

Der Gesamtplasmaspiegel von VB12, MMA und Hcy wurde mit dem Maus-VB12-ELISA-Kit (J&L Biological), dem Maus-Methylmalonsäure-ELISA-Kit (J&L Biological) bzw. dem Maus-Hcy-ELISA-Kit (mlbio) gemessen.

Folsäure im Plasma wurde durch Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit einer Tandem-Massenspektrometrie-Methode (LC-MS/MS) (AB SCIEX, USA, Triple Quad 6500+) nachgewiesen. Die Flussrate wurde auf 0,2 ml/min eingestellt. Die chromatographische Trennung wurde auf einer analytischen Säule ACQUITY UPLC HSST3 C18 (1,8 μm, 2,1 mm x 100 mm) durchgeführt. Die mobile Phase enthielt eine Mischung aus 0,1 % Ameisensäure in Wasser (A) und Acetonitril (B). Die Gradientenelution wurde angewendet und die MS-Detektion erfolgte im positiven Modus. Die Daten wurden mit einem Mehrfachreaktionsmonitor gesammelt. Die für die Methode optimierten MS/MS-Parameter sind in der Ergänzungstabelle 7 aufgeführt. Der Gradient wurde wie folgt eingestellt: 5 %–5 % B 0–0,5 min, 5 %–80 % B 0,5–5 min, 80 %–80 % B 5–6 Min., 80 %–5 % B 6–6,1 Min., 5 %–5 % B 6,1–8 Min. Ein Aliquot von 50 μl Plasmaprobe wurde mit 150 μl kaltem 20:80 H2O: MeOH (0,1 % Ascorbinsäure und Ameisensäure) mit internem Standard (IS) gemischt, vortexiert und dann 10 Minuten lang bei 13.000 g und 4 °C zentrifugiert . Ein Aliquot von 2 μl Überstand wurde mittels LC-MS/MS analysiert. Die relative Quantifizierung wurde anhand des Verhältnisses Analyt/IS-Peakfläche berechnet, das aus extrahierten biologischen Proben ermittelt wurde.

Lebergewebe wurden in 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit Ölrot O (ORO) gefärbt. Fettgewebe wurden in 4 % Paraformaldehyd fixiert und durch Immunfärbung mit Adiponektin-Antikörper (Bioss, Kat.-Nr. bs-0471R, 1:200) gefärbt. Die Fettgewebeschnitte wurden auch mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Für die Immunfluoreszenzfärbung wurden die Objektträger mit Insulin (Proteintech, Kat.-Nr. 15848-1-AP, 1:100) und Glucagon-Antikörper (Proteintech, Kat.-Nr. 67286-1-Ig, 1:200) inkubiert und mit DAPI gegengefärbt, um Bilder zu erhalten.

Das Gewebeprotein wurde durch SDS-PAGE-Elektrophorese aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Membran wurde mit primären Antikörpern gegen AHR (Proteintech, Kat.-Nr. 17840-1-AP, 1:1000), CYP1A1 (Proteintech, Kat.-Nr. 13241-1-AP, 1:1000) oder GAPDH (Cell Signaling Technology, Kat # 2118, 1:20000) über Nacht bei 4 °C.

Die Gesamt-RNA wurde mit dem TRIzol-Reagenz aus dem Ileumgewebe der Maus extrahiert. Die Proben wurden einer 150-bp-Paired-End-Sequenzierung unter Verwendung der Illumina novaseq 6000-Plattform unterzogen. Saubere Lesevorgänge wurden durch Entfernen von Lesevorgängen mit Adapter, Lesevorgängen mit N-Base und Lesevorgängen mit geringer Qualität (Qphred <= 20) aus Rohdaten erzielt. Die Lesevorgänge wurden dann mithilfe von Hisat2 (Version 2.0.5) auf das Mausgenom (Mus_musculus.GRCm39.dna.primary Assembly.fa) ausgerichtet, und featureCounts (Version 1.5.0-p3) wurde verwendet, um die jeweils zugeordneten Lesezahlen zu zählen Gen. Die durchschnittliche Leseabdeckung betrug 43.675.559 Lesevorgänge/Probe, wobei durchschnittlich 96 % der Lesevorgänge erfolgreich auf das Mausgenom abgebildet wurden. Sequenzierte Lesevorgänge wurden auf FPKM normalisiert und unterschiedlich exprimierte Gene zwischen B. ovatus + MET und Metformin oder B. ovatus-Maus-Ileumgeweben wurden unter Verwendung des DESeq2 R-Pakets bestimmt. Die Anreicherungsanalyse wurde mit ClusterProfiler (Version 3.4.4) durchgeführt. Die lokale Version des Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)-Tools http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp, GO-, KEGG-, Reactome-, DO- und DisGeNET-Datensätze wurden unabhängig voneinander für GSEA verwendet. Die P-Werte der Mehrfachvergleiche wurden mit der ursprünglichen FDR-Methode von Benjamini und Hochberg angepasst, FDR < 0,05. Als Schwelle für eine signifikant unterschiedliche Expression wurden ein korrigierter P-Wert von 0,05 und ein absoluter Foldchange von 2 festgelegt.

Für die statistische Analyse wurden GraphPad Prism Version 8.0, IBM SPSS Statistics 26 und R (Version 3.5.1 und 4.2.0) verwendet. Die experimentellen Daten wurden als Mittelwert ± SEM oder Mittelwert ± SD angezeigt. Die Stichprobengröße wurde auf der Grundlage früherer Erfahrungen, der Probenverfügbarkeit und zuvor gemeldeter Studien geschätzt. Von der Datenanalyse wurden keine Daten ausgeschlossen. Ungepaarte unabhängige Student-t-Tests (zwischen zwei Gruppen) und einfaktorielle ANOVA mit Tukey- oder Dunnett-Tests (zwischen mehreren Gruppen) wurden verwendet, um Unterschiede bei normalverteilten und homogenen Varianzen zu vergleichen. Nicht normalverteilte oder heterogene Daten wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test (Wilcoxon-Rangsummentest, zwischen zwei Gruppen) oder dem Kruskal-Wallis-Test (zwischen mehreren Gruppen) verglichen. Als Grenzwert für die statistische Signifikanz wurde ein Benjamini-Hochberg-bereinigter P-Wert (FDR) von 0,05 verwendet, sofern nicht anders angegeben. Die Korrelationsanalyse des Darmmikrobioms und der klinischen Merkmale der Probanden wurde mithilfe des Rangkorrelationskoeffiziententests nach Spearman untersucht. Statistische Signifikanz wird durch Sternchen (*) angezeigt: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, ns, nicht signifikant.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die rohen Metagenomdaten und bakteriellen RNA-Sequenzierungsablesungen sind über das NCBI Sequence Read Archive (PRJNA910923 bzw. PRJNA989277) zugänglich. Alle anderen Daten, die zur Bewertung der Schlussfolgerungen in der Arbeit erforderlich sind, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

In dieser Studie wurden keine neuen R-Analyseskripte oder -codes erstellt.

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Diese Arbeit wurde vom National Key Research and Development Program of China (Nr. 2021YFA1301200), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82073945, 82074000 und 81874329), dem Postgraduate Scientific Research Innovation Project der Provinz Hunan (Nr. CX20200121), die Fundamental Research Funds for Central Universities der Central South University (Nr. 2020zzts252) und das Projektprogramm des National Clinical Research Center for Geriatric Disorders (Xiangya Hospital, Zuschuss Nr. 2020LNJJ06). Die Autoren danken den Teilnehmern (RL und YLP) für ihre freundliche Unterstützung und Zusammenarbeit bei der Studie und dem High Performance Computing Center der Central South University für die teilweise Unterstützung dieser Arbeit.

Abteilung für klinische Pharmakologie, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, VR China

Manyun Chen, Yan Shu, Qing Li, Honghao Zhou, Weihua Huang und Wei Zhang

Institut für klinische Pharmakologie, Central South University, Hunan Key Laboratory of Pharmacogenetics, Changsha, VR China

Manyun Chen, Qing Li, Honghao Zhou, Weihua Huang und Wei Zhang

Technisches Forschungszentrum für angewandte Technologie der Pharmakogenomik, Bildungsministerium, Changsha, VR China

Manyun Chen, Qing Li, Honghao Zhou, Weihua Huang und Wei Zhang

Nationales klinisches Forschungszentrum für geriatrische Erkrankungen, Changsha, VR China

Manyun Chen, Qing Li, Honghao Zhou, Weihua Huang und Wei Zhang

Abteilung für Pharmazeutische Wissenschaften, School of Pharmacy, University of Maryland in Baltimore, Baltimore, MD, USA

Yan Shu

Zhengzhou Central Hospital, angegliedert an die Zhengzhou University, Zhengzhou University, Zhengzhou, VR China

Zhiqiang Kang

Shenzhen Center for Chronic Disease Control and Prevention, Shenzhen, VR China

Tao Liu

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WZ und WHH konzipierten und betreuten die Studie. MYC konzipierte das Versuchsdesign, führte die wichtigsten In-vitro/vivo-Experimente durch, beteiligte sich an der Dateninterpretation und verfasste den Originalentwurf. YS, QL und HHZ haben das Manuskript überprüft und bearbeitet. ZQK rekrutierte Patienten und verwaltete die Stuhlsammlung der Patienten. TL verwaltete die Sequenzierung der Stuhlproben. Das WZ ist der Garant dieser Arbeit und hatte als solcher vollständigen Zugriff auf alle Daten der Studie und übernimmt die Verantwortung für die Integrität der Daten und die Genauigkeit der Datenanalyse. Alle Autoren beteiligten sich an der Bearbeitung des Papiers und genehmigten das endgültige Manuskript.

Korrespondenz mit Weihua Huang oder Wei Zhang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Die Kohorte wurde von der medizinischen Ethikkommission des Xiangya-Krankenhauses der Central South University (ID: 2019040116) genehmigt und entsprach der Erklärung von Helsinki und der guten klinischen Praxis. Alle Teilnehmer gaben vor der Anmeldung eine schriftliche Einverständniserklärung ab. Alle Teilnehmer erhielten eine Aufklärung über Diabetes, Anthropometrie, Stoffwechseluntersuchungen und biochemische Tests. Diese Studie wurde im chinesischen Register für klinische Studien (ChiCTR1900022997) registriert. Die experimentellen Verfahren mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Laboratory Animal Center der Central South University durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (Nr. CSU-2022-0403) genehmigt.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Chen, M., Shu, Y., Li, Q. et al. Bacteroides ovatus beschleunigt den Metformin-induzierten Vitamin-B12-Mangel bei Typ-2-Diabetes-Patienten durch die Anreicherung von Cobalamin. npj Biofilms Microbiomes 9, 51 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00419-y

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Eingegangen: 25. Februar 2023

Angenommen: 10. Juli 2023

Veröffentlicht: 24. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00419-y

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