Bilder von Enzymen in Aktion enthüllen Geheimnisse des Antibiotikums

Von Carol Clark, 11. August 2023

Eine Reihe von Bildern, die mit Kryoelektronenmikroskopie aufgenommen wurden, zeigt, wie ein bakterielles Enzym ein Ribosom verändert. (Pazifisches Nordwestzentrum für Kryo-EM)

Bakterien greifen auf ein Waffenarsenal zurück, um die Medikamente zu bekämpfen, die sie abtöten sollen. Zu den häufigsten dieser Waffen gehören Ribosomen-modifizierende Enzyme. Diese Enzyme kommen immer häufiger vor und kommen weltweit in klinischen Proben einer Reihe arzneimittelresistenter Bakterien vor.

Jetzt haben Wissenschaftler die ersten Bilder einer wichtigen Klasse dieser Enzyme in Aktion aufgenommen. Die Bilder zeigen, wie sich die Enzyme an einer bestimmten Stelle des bakteriellen Ribosoms festsetzen und es wie eine Pinzette zusammendrücken, um ein RNA-Nukleotid zu extrahieren und es zu verändern. Die Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS) veröffentlichten die Ergebnisse unter der Leitung von Wissenschaftlern der Emory University.

Die fortschrittliche Technik der Kryoelektronenmikroskopie ermöglichte die ultrahochauflösenden, dreidimensionalen Schnappschüsse.

„Sehen heißt glauben“, sagt Christine Dunham, Emory-Professorin für Chemie und Mitautorin des Artikels. „Sobald man sieht, wie biologische Strukturen im wirklichen Leben auf atomarer Ebene interagieren, ist das wie das Lösen eines Puzzles. Man sieht, wie alles zusammenpasst, und bekommt eine klarere Vorstellung davon, wie die Dinge funktionieren.“

Die Erkenntnisse können zur Entwicklung neuer Antibiotikatherapien führen, um die Arzneimittelresistenzaktivitäten von RNA-Methyltransferase-Enzymen zu hemmen. Diese Enzyme übertragen einen kleinen Kohlenwasserstoff, eine sogenannte Methylgruppe, von einem Molekül auf ein anderes, ein Vorgang, der als Methylierung bezeichnet wird.

„Methylierung ist eine der kleinsten chemischen Modifikationen in der Biologie“, sagt Graeme Conn, Professor für Biochemie an der Emory's School of Medicine und Mitautor der Arbeit. „Aber diese winzige Modifikation kann die Biologie grundlegend verändern. In diesem Fall verleiht es Resistenzen, die es Bakterien ermöglichen, einer ganzen Klasse von Antibiotika auszuweichen.“

Sowohl Conn als auch Dunham sind außerdem Mitglieder des Emory Antibiotic Resistance Center.

Erstautorin des Artikels ist Pooja Srinivas, die die Arbeit als Doktorandin im Graduiertenprogramm von Emory für Molekular- und Systempharmakologie durchgeführt hat. Seitdem hat sie ihren Abschluss gemacht und ist jetzt Postdoktorandin an der University of Washington.

Dunham ist ein führender Experte für das Ribosom – eine ausgeklügelte Struktur, die wie eine Fabrik innerhalb einer Zelle zur Herstellung von Proteinen funktioniert. Proteine ​​sind die Maschinen, die Zellen zum Laufen bringen, während Nukleinsäuren wie DNA und RNA die Baupläne für das Leben speichern. Das Ribosom besteht größtenteils aus RNA, die nicht nur Informationen speichert, sondern auch als Enzym fungieren und chemische Reaktionen katalysieren kann.

Ein Ziel von Dunhams Labor ist es, Wege zu finden, bakterielle Ribosomen zu manipulieren, um sie anfälliger für antimikrobielle Mittel zu machen. Wenn ein antimikrobielles Mittel bakterielle Ribosomen erfolgreich inaktiviert, unterbricht dies die Produktion von Proteinen, die für das Wachstum und Überleben der Bakterien unerlässlich sind.

Die Idee besteht darin, Unterschiede zwischen menschlichen zellulären Ribosomen und bakteriellen Ribosomen auszunutzen, sodass nur die Bakterien von einem antimikrobiellen Medikament angegriffen werden.

Antimikrobielle Mittel müssen jedoch die bakterielle Abwehr überwinden.

„Es ist wie ein molekulares Wettrüsten“, erklärt Dunham. Bakterien entwickeln ständig neue Waffen zur Abwehr von Medikamenten, während Wissenschaftler neue Strategien entwickeln, um Bakterien zu entwaffnen.

Conn ist ein führender Experte für bakterielle Abwehrwaffen, die als ribosomale RNA-Methyltransferase-Enzyme bekannt sind. Diese Enzymfamilie wurde ursprünglich in Bodenbakterien entdeckt. Mittlerweile kommen sie zunehmend bei bakteriellen Infektionen bei Menschen und Tieren vor, was die Behandlung dieser Infektionen erschwert.

„Sie tauchen immer häufiger in klinischen Proben einiger böser bakterieller Krankheitserreger in verschiedenen Teilen der Welt auf“, sagt Conn.

Die Enzyme können tödliche Arzneimittelresistenzen bei Krankheitserregern wie E. coli, Salmonellen, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa und Enterobacteriaceae auslösen. Die Enzyme fügen an einer bestimmten Stelle des bakteriellen Ribosoms eine Methylgruppe hinzu. Dieser Zusatz blockiert die Fähigkeit einer Klasse von Antibiotika, die als Aminoglykoside bekannt sind, sich zu binden und ihre antibakterielle Wirkung auszulösen.

Für das PNAS-Papier konzentrierten sich die Forscher auf einen Übeltäter innerhalb dieser Enzymfamilie, der als ribosomale RNA-Methyltransferase C oder RmtC bekannt ist.

Seit Jahrzehnten verlassen sich Forscher auf eine Technik namens Röntgenkristallographie, um die atomaren Details der Funktionsweise molekularer Maschinen aufzudecken, wenn die Moleküle in einem Kristall angeordnet sind.

Im Jahr 2015 erhielt Dunhams Labor beispielsweise durch Röntgenkristallographie präzise Bilder davon, wie ein Enzym namens HigB RNA zerreißt, um das Wachstum der Bakterien zu hemmen. Durch die Hemmung des Wachstums der Bakterien, aus denen es besteht, etabliert HigB einen ruhenden „Persistenzzellzustand“, der die Bakterien tolerant gegenüber Antibiotika macht.

Die Geheimnisse darüber, wie das RmtC-Enzym mit dem Ribosom interagiert, entgingen jedoch der Röntgenkristallographie.

„RmtC ist viel komplizierter“, erklärt Dunham. „Aus grundlagenwissenschaftlicher Sicht ist es ein interessantes Enzym, weil es so anders aussieht als andere.“

Jüngste Fortschritte in der Kryoelektronenmikroskopie haben die Möglichkeit eröffnet, die komplexen Mechanismen von RmtC genauer zu untersuchen.

Die Kryoelektronenmikroskopie erfordert keine Kristallisation, um die Strukturen von Molekülen und ihre Wechselwirkungen aufzudecken. Stattdessen werden flüssige Proben schnell eingefroren, um eine glasartige Matrix zu bilden. Die glasartige Matrix bewahrt die dreidimensionale Struktur der Moleküle und schützt sie vor der Zerstörung durch den intensiven Elektronenstrahl.

Meisam Nosrati, ein ehemaliger Postdoktorand im Conn-Labor und Mitautor des PNAS-Artikels, bereitete Proben von RmtC vor, die mit einem Teil eines E. coli-Ribosoms interagierten. Er nutzte das Fachwissen der Co-Autorin Lindsay Comstock, einer Chemikerin an der Wake Forest University, die eine Technik entwickelte, um das Enzym an der benötigten Position einzufangen und zu stabilisieren.

Anschließend fror Nosrati die Proben auf einem winzigen Gitter ein und schickte sie zur Bildgebung an das Pacific Northwest Center for Cryo-EM.

Als Doktorand im Dunham-Labor analysierte und interpretierte Srinivas dann den Mikroskopiedatensatz. Mithilfe von Computeralgorithmen fügte sie Tausende Einzelbilder zusammen. Das Ergebnis verwandelte die Bilder in ein Daumenkino, das die komplizierte Struktur von RmtC in Aktion zeigte.

„Das Enzym klammert sich wie eine Zange an das Ribosom“, erklärt Dunham. „Es verstärkt seinen Griff, bis es ein Nukleotid aus dem Inneren einer RNA-Helix herausdrückt. Anschließend wird dieses Nukleotid chemisch verändert.“

Das Enzym legt äußerst genau fest, wo es an das Ribosom bindet, ein riesiges Makromolekül, das aus 50 verschiedenen Proteinen und 6.000 verschiedenen RNA-Nukleotiden besteht.

Die Forscher verwendeten biochemische Techniken, um zu bestätigen, dass ihre Beobachtungen mit früheren Erkenntnissen darüber übereinstimmten, wie RmtC Bakterien resistent gegen antimikrobielle Aminoglykosid-Wirkstoffe macht, die auf das Ribosom abzielen.

Die Forscher versuchen nun, auf Grundlage der neuen Informationen neue Wege zu entwickeln, um den Auswirkungen von RmtC und verwandten Enzymen entgegenzuwirken.

„Das Wissen über die Form des Enzyms bei der Durchführung seiner chemischen Reaktion eröffnet uns neue Angriffspunkte, um seine Wirkung zu hemmen“, sagt Conn. „Zum Beispiel könnten wir die Zangenwirkung des Enzyms gezielt einsetzen, um zu verhindern, dass es sich zusammendrückt und an das Ribosom bindet. Wir wissen jetzt, dass das Enzym auf seiner Oberfläche eine Tasche bildet, in der ein kleines Molekül sitzen könnte, um diese Aktion zu blockieren.“

Weitere Co-Autoren des PNAS-Artikels sind Natalia Zelinskaya und Debayan Dey, Forscher im Conn-Labor.

Die Finanzierung der Arbeit erfolgte durch die National Institutes of Health und den Burroughs Wellcome Fund Investigator in the Pathogenesis of Infectious Disease Award.